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id stringlengths 36 65	type stringclasses 4 values	title stringlengths 0 315	context stringlengths 194 18.2k	questions listlengths 1 1
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-01a9-47dd-aa59-4eaeb52863e5_01	생명LA	탈지 들깨박 효소분해물의 제조와 Leuconostoc mesenteroides 배양에의 활용	<p>따라서 본 연구에서는 들기름 제조공정의 부산물로 생성되는 들깨박의 불용성 물질을 가용화하여 생리활성의 변화 및 미생물 배양 배지로서의 가능성을 확인함으로써 들깨박의 산업직 활용을 위한 기초 자료를 제시하자고 하였다. 들깨박을 직접 기질로 하여 상업용 단백질 및 탄수화물 분해효소를 선별하고, 효소처리 조건을 확립하였다. 또한 효소분해로 얻어진 들깨박 효소분해물의 항산화 활성 및 젖산균 배양배지로서의 활용가능성을 효소처리하지 않은 들깨박과 비교하였다.</p> <h2>재료 및 방법</h2> <h3>실험재료</h3> <p>탈지 들깨박은 경상남도 창원시 마산합포구 진전면에서 수확한 들깨에서 들깨유를 제조 후 부산물로 얻어지는 것을 이용하였다. Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, Protamex, Ceremix, Pectinase, Viscozyme은 Novozyme사(Bagsvaerd, Denmark)의 제품을 사용하였다. D-glucose, \(3 \), \(5 \)-dinitrosalicylic acid (DNS), bovine serum albumin (BSA), Bradford 시약, \(1 \), \(1 \)-diphenyl- \(2 \)-picrylhyrazyl(DPPH), \(2 \), \(2 \)'-azino-bis- \(3 \)-ethylbenzothiazoline- \(6 \)-sulfonic acid(ABTS), Folin-Ciocalteu 시약, gallic acid는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 젖산균은 김치에서 분리한 Leuconostoc mesenteroides \(310)- \(12 \) 균주를 Difco사(Detroit, MI, USA)의 Lactobacilli MRS agar 배지에 계대배양하여 사용하였다.</p> <h3>들깨박 효소처리</h3> <p>들깨박의 가용화를 위해 단백질 분해효소인 Alcalase, Flavourzyme, Neutrase, Protamex와 탄수화물 분해효소인 Ceremix, Pectinase, Viscozyme을 사용하였다. 들깨박은 분쇄한 후 \(200 \) mesh체로 분리한 분말을 실험에 사용하였다. 증류수에 들깨박 분말을 \( 10 \% \) \( ( \mathrm { w } / \mathrm { w } ) \) 로 현탁시킨 시료를 열처리 \( \left (121 ^ {\circ } \mathrm { C } , 20 \mathrm { ~min } \right ) \) 하고 실온에서 충분히 냉각시킨 후 \( 0.1 \mathrm { ~N } \mathrm { NaOH } \) 혹은 \( \mathrm { HCl } \) 로 각각의 효소 반응 최직 \( \mathrm { pH } \)로 조절한 다음 효소를 들깨박 중량의 \( 1 \%( \mathrm { w } / \mathrm { w } ) \) 로 가하여 각각의 효소 반응 최직 온도에서 \(2 \)시간 동안 진탕하였다. 반응 종료 후 꿇는 물에 \(5 \)분간 열처리하고 원심분리 \( \left (3,000 \times \mathrm { g } , 10 \mathrm { ~min } , 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \right ) \)하여 상등액을 분석 시료로 활용하였다. 효소를 첨가하지 않고 갇은 조건으로 처리한 들깨박 현탁액의 상등액을 대조군으로 하였다.</p>	[ "본 연구는 들기름 제조 과정에서 발생하는 부산물인 들깨박의 가용화와 그로 인한 생리활성 변화를 연구하였다. 들깨박을 기질로 사용하여 상업용 단백질과 탄수화물 분해효소를 선별하였고, 이를 이용한 효소처리 조건을 확립하였다. 효소 처리를 통해 얻어진 들깨박의 항산화 활성과 젖산균 배양배지로서의 활용 가능성을 살펴보았다. 들깨박의 가용화를 위해 여러 가지 단백질과 탄수화물 분해효소를 사용하였다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-01a9-47dd-aa59-4eaeb52863e5_00	생명LA	탈지 들깨박 효소분해물의 제조와 Leuconostoc mesenteroides 배양에의 활용	<h1>탈지 들깨박 효소분해물의 제조와 Leuconostoc mesenteroides 배양에의 활용</h1> <h2>서 론</h2> <p>들깨(Perilla frutescens)는 식용유지를 얻기 위해 우리나라에서 가장 많이 생산되는 유지작물로 종자에 oleic acid, linoleic acid, \( \alpha \)-linolenic acid 등 약 \( 90 \% \)의 불포화 지방산과 palmitic acid 등 약 \( 10 \% \)의 포화지방산으로 구성된 양질의 지빙이 \( 40 \% \) 이상 함유되어 있으며, rosmarinic acid와 ursolic acid 등과 같은 phenolic 화합물과 terpenoid 성분에 의한 항산화, 항염증 등의 생리활성도 보고된 우수한 식품재료이다. 들깨 종자에 약 \( 16 \% \) 함유되어 있는 단백질은 참깨 단백질과 유사하게 함황 아미노산이자 필수 아미노산인 methionine의 함량이 우수하여 대두와 같이 상대직으로 methionine이 부족한 식품의 영양학적 특성을 보완할 수 있는 잠재력을 갖은 식품소재이다. 영양학적인 효과뿐만 아니라 들깨 단백질 가수분해물에는 유화와 거품 형성에 효과직인 펩타이드, 항산화 활성과 \( \alpha- \)glucosidase와 ACE 저해 활성을 갖는 펩타이드가 존재한다는 보고를 참고하면 들깨 단백질은 식품 가공 및 생리활성 소재로도 유용한 자원이다.</p> <p>들깨 종자의 착유로 발생되는 부산물인 들깨박은 단백질과 탄수화물이 각각 \( 30-40 \% \) 함유되어 있으며, 다양한 항산화 phenolic 화합물도 존재하므로 단백질, 탄수화물, phenolic 화합물의 공급원으로 활용이 가능한 자원이나 대부분은 사료로 이용되거나 폐기되고 있다. 들깨박 phenolic 화합물의 활용을 위하여는 주로 들깨박 에탄올이나 메탄올 추출물의 항산화, 항돌연변이, 항염증 활성 등을 조사하였다. 들깨박 단백질 활용을 위하여 산과 알갈리를 사용하는 화학적인 방법, 초음파를 이용한 물리적인 방법 및 효소 처리 등의 방법으로 추출하는 보고가 있으며, 식품 소재로 들깨 단백질을 이용하기 위하여 단백질 분해효소의 처리로 얻어진 펩타이드의 물성(용해도, 물과 기름 흡수력, 유화능과 거품 형성능)에 관한 보고도 있다. 들깨박에 단백질 분해효소를 사용하는 연구는 대부분 들깨박 현탁액을 알칸리로 처리하여 들깨박 단백질을 추출한 후 단백질 분해효소를 사용하는 것으로 단백질을 분리하는 전처리 공정이 포함되어 있다. 또한 들깨박 다당류의 추출을 위하여 초음파와 알칸리를 동시에 사용하는 물리-화학적인 방법과 상업용 효소인 Celluclast \( 1.5 \mathrm { ~L } \)과 Viscozyme \( \mathrm { L } \)을 사용하는 효소 처리법 등이 보고되어 있으나, 효소 처리법은 단백질 분해효소의 처리와 유사하게 들깨박 자체를 사용하지 않고 미리 제조한 들깨박의 cellulose와 hemicellulose 분회을 기질로 사용하였다. 즉, 효소를 이용한 들깨박 단백질과 탄수화물을 활용하기 위한 기존의 연구는 들깨박의 전처리로 다당류나 단백질을 분리한 후 탄수화물 분해효소와 단백질 분해효소를 각각 처리한 것이며, 들깨박을 직접 기질로 사용하면서 탄수화물 분해효소와 단백질 분해효소의 처리 조건에 관한 연구는 미미하다.</p>	[ "들깨는 oleic acid, linoleic acid, \\( \\alpha \\)-linolenic acid 등 대부분이 불포화 지방산으로 이루어진 풍부한 지방원이며, 또한 다양한 생리활성을 가진 phenolic 화합물과 terpenoid 성분도 함유하고 있다. 그러나 들깨박이라는 착유 후의 부산물은 주로 사료로 사용되거나 폐기되며, 이 부산물은 단백질, 탄수화물, phenolic 화합물 등이 풍부하게 들어있어 다른 용도로도 활용 가능성이 높다. 또한 탈지 들깨박 효소분해물의 제조와 Leuconostoc mesenteroides 배양에도 활용된다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-01a9-47dd-aa59-4eaeb52863e5_02	생명LA	탈지 들깨박 효소분해물의 제조와 Leuconostoc mesenteroides 배양에의 활용	<p>들깨박의 효소 처리 조건을 결정하였다. 들깨박의 효소처리는 탄수화물 분해효소(Ceremix)와 단백질 분해효소(Alcalase)를 \( 1: 1 \) 비율로 동시에 첨가하는 반응조건을 조사하였다. 최적 \( \mathrm { pH } \)를 확인하기 위하여 열처리한 들깨박 \( 10 \%( \mathrm { w } / \mathrm { w } ) \) 현탁액을 다양한 \( \mathrm { pH } ( \mathrm { pH } 5.0-8.0\))로 조절하고 Ceremix와 Alcalase를 각각 들깨박 중량의 \( 0.5 \% \) 첨가한 후 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2시간 반응시킨 다음 열처리와 원심분리하여 얻은 상등액을 분석하였다. 최적 효소 사용량은 열처리한 들깨박 \( 10 \%( \mathrm { w } / \mathrm { w } ) \) 현탁액 \( ( \mathrm { pH } 7.0\))에 Ceremix와 Alcalase를 각각 들깨박 중량의 \( 0.25 ~ 1.5 \% \) 첨가하고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2시간 반응시킨 후 동일한 빙법으로 준비한 상등액을 분석하여 결정하였다. 효소 반응시간은 열처리 들깨박 현탁액(\(10 \%, \mathrm{pH} 7.0\))에 Ceremix와 Alcalase를 각각 들깨박 중량의 \( 1 \% \) 로 첨가하고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 0~3 시간 반응시킨 후 동일한 빙법으로 준비한 상등액을 분석하여 결정하였다.</p> <p>실험 결과는 SPSS Statistics (Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., Chicago, IL, USA, version 23.0)를 이용한 t-검정으로 시료간 유의성을 조사하였다(유의수준 \( p<0.05) \).</p> <h3>환원당, 단백질 및 폴리페놀 함량</h3> <p>효소처리와 원심분리를 통하여 얻은 상등액의 환원당 함량은 각각 포도당을 표준물질로 \( \mathrm { DNS } \) 법으로, 단백질 함랑은 \( \mathrm { BSA } \) 를 표준물질로 Bradford법으로 분석하였다. 또한 풀리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약을 사용하여 Folin과 Denis의 방법으로 분석하였고, 함량은 gallic acid equivalent (GAE)로 나타내었다.</p> <h3>들깨박 효소분해물의 항산화 활성</h3> <p>\( \mathrm { DPPH } \) 유리 라디칼 소거 활성은 Blois 방법으로 확인하였는데, 들깨박 효소분해물 \( 0.2 \mathrm { ~mL } \)에 에탄올 \( 2 \mathrm { ~mL } \) 와 \( 0.2 \mathrm { mM } \) \( \mathrm { DPPH } \) 용액 \( 0.8 \mathrm { ~mL } \) 를 혼합하여 상온에서 30분 방치한 후 \(517 \) \( \mathrm { nm } \) 에서 흡광도를 추정하였다. ABTS 양이온 라디칼 소거 활성은 \( \operatorname { Re } \) 등의 방법으로 측정하였는데, 들깨박 효소분해물 \( 0.1 \) \( \mathrm { mL } \)와 \( \mathrm { ABTS } \) 용액(흡광도: \( 1.5 \pm 0.2 \) ) \( 3.0 \mathrm { ~mL } \)를 혼합하여 상온에서 1.5시간 방치한 후 \( 414 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다. \( \mathrm { DPPH } \)와 \( \mathrm { ABTS } \) 라디칼 소거활성 \( ( \%) \)은 \( [( \) 증류수 첨가군 흡광도 \( - \) 시료 흡광도)/증류수 첨가군 흡광도] \( \times 100 \)의 식으로 계산하였다.</p>	[ "이 실험에서는 들깨박의 효소 처리를 위하여 탄수화물 분해효소와 단백질 분해효소를 1:1 비율로 섞어 첨가하였다. 단백질 및 폴리페놀 함량을 확인 하기 위해여 효소처리와 원심분리 후 얻은 상등액을 DNS법으로 포도당을 확인하고, Bradford 법으로 단백질을 확인하였다. 항산화 활성은 Blois 방법으로 확인하였다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-01a9-47dd-aa59-4eaeb52863e5_04	생명LA	탈지 들깨박 효소분해물의 제조와 Leuconostoc mesenteroides 배양에의 활용	<caption>\( { } ^ { 1) } \) Values were means \( \pm \mathrm { SD } (n = 3) \)</caption> <caption>\( { } ^ { 2) } \) Data were statistically different from the value of control \( \left ( { } ^ { * } p<0.05 \right ) \) by t-test</caption> <h3>들깨박 효소분해물 제조</h3> <p>선별한 단백질 분해효소 Alcalase와 탄수화물 분해효소 Ceremix 의 반응 조건 \( ( \mathrm { pH } \), 효소 첨가량 및 반응시간)의 영향을 조사하였다. 두 종류 이상의 효소를 하나의 기질에 처리하는 경우 반응조건이 유사하면 두 효소를 동시에, 특히 반응 \( \mathrm { pH } \) 가 상이한 경우에는 순차직으로 사용하는 것이 효과직일 수 있다. 본 연구의 Ceremix는 \( \mathrm { pH } \) \(5.0 \), Alcalase는 \( \mathrm { pH } \) \(6.5 \) \(8.5 \)에서 최대 활성을 보이나 공정의 간편성과 Alcalase의 넓은 \( \mathrm { pH } \) 조건을 고려하여 두 효소를 동시에 처리하기 위한 최직의 \( \mathrm { pH } \) 조건을 조사하였다. 이때 들깨박과 효소를 증류수에 넣고 \( \mathrm { pH } \) 를 조절하지 않은 것을 대조군으로 하였다. 각각의 실험군은 열처리한 들깨박 \( 10 \% \quad( \mathrm { w } / \mathrm { w } ) \) 현탁액을 \( \mathrm { pH } \quad 5.0 \sim 8.0 \) 로 조절하고 Ceremix와 Alcalase를 각각 들깨박 중량의 \( 0.5 \% \) 씩 첨가한 후 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(2 \)시간 반응시키고 상등액의 환원당과 단백질 함량을 대조군과 비교하였다(Fig. \(1 \)A). 환원당 함량은 \( \mathrm { pH } \) \(7 \)에서, 단백질 함량은 \( \mathrm { pH } 8 \) 에서 공히 대조군보다 \(2 \)배 증가하였다. 환원당 함량은 \( \mathrm { pH } \quad6 \sim8 \) 에서, 단백질 함량은 \( \mathrm { pH } \quad 7 \sim 8 \)에서 큰 차이를 보이지는 않았으나 미생물 배지로 활용하기 위하여 환원당이 많이 생성되는 \( \mathrm { pH } \) \(7 \)을 반응 조건으로 선택하였다. 두 효소의 최적 첨가량을 설정하기 위하여 들깨박 \( 10 \%( \mathrm { w } / \mathrm { w } ) \) 현탁액 \( ( \mathrm { pH } \) \(7.0 \))에 Ceremix와 Alcalase를 각각 들깨박 중량의 \( 0.25 \sim 1.5 \% \) 첨가하고 \( 50 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(2 \)시간 반응시키고 상등액의 환원당과 단백질 함랑을 측정하였다(Fig. \(1 \)B). 가용화된 환원당과 단백질 함랑은 유사하게 효소 처리 농도 \( 1.0 \% \) 까지 급격하게 증가한 후 \( 2 \% \) 까지 매우 완만하게 증가하였다. 따라서 효소반응액의 환원당과 단백질 함량을 고려하면 총 효소 첨가랑은 \( 2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { w } ) \) (Ceremix와 Alcalase 각 \( 1 \% \) )가 가장 직절한 것으로 여겨진다. 이는 스피루리나 추출물의 제조 시 Alcalase \( 1 \% \) 이상의 조건에서 고형분 회수율의 변화가 미미하다는 보고와도 잘 일치하였다. 효소 반응시간을 결정하기 위하여 Ceremix와 Alcalase를 각각 \( 1 \% \) 조건에서 반응시간에 따른 환원당과 단백질 함량의 변화를 조사하였다(Fig. \( 1 \)C). 환원당 함량은 \(3 \)시간까지 시간에 비례하여 지속적으로 증가하였으나, 단백질 함량은 반응 \(2 \)시간 후 증가하지 않는 앙상을 보였다. 이러한 결과는 Alcalase로 유청 단백질을 가수분헤하는 보고에서 반응 \(50 \)분까지 가수분해가 급속히 증가한 후 반응 \(150 \)분 이후 감소되는 결과와 유사하였다. 따라서 반응시긴에 따른 단백질 함량의 증가를 고려하면 들깨박에 Ceremix와 Alcalase의 효소 반응 시간은 \(2 \)시간이 적절하였다. 이상의 반응 조건으로 효소 처리한 결과 상등액의 환원당과 단백질 함량은 각각 \( 6.87 \) 과 \( 3.22 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 이었다. 이는 효소 처리하지 않은 들깨박 추출물(대조군)의 환원당과 단백질 함량이 각각 \( 4.36 \) 과 \( 2.67 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } _ {\text { 인 } } \) 것에 비헤 상당히 높게 나타났다.</p>	[ "본 논문은 선별한 단백질 분해효소 Alcalase와 탄수화물 분해효소 Ceremix의 반응 조건과 효소 첨가량, 반응시간의 영향을 조사하였다. Ceremix와 Alcalase는 각기 다른 \\( \\mathrm { pH } \\)에서 최대 활성을 보이지만 공정의 간편성과 Alcalase의 넓은 \\( \\mathrm { pH } \\) 조건을 고려해 두 효소를 동시에 처리하기 위한 최직의 \\( \\mathrm { pH } \\)조건을 분석하였다. 실험 결과 효소반응액의 환원당과 단백질 함량을 고려했을 때 총 효소 첨가랑은 \\( 2 \\%( \\mathrm { w } / \\mathrm { w } ) \\)가 적절하고, 반응시긴에 따른 단백질 함량의 증가를 고려했을 때 들깨박에 Ceremix와 Alcalase의 효소 반응 시간은 \\(2 \\)시간이 적절하였다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-01a9-47dd-aa59-4eaeb52863e5_05	생명LA	탈지 들깨박 효소분해물의 제조와 Leuconostoc mesenteroides 배양에의 활용	<h3>들깨박 효소분해물의 항산화 활성</h3> <p>본 연구에서 확립된 방법으로 제조한 들깨박 효소분해물의 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성과 DPPH 유리 라디칼 소거 활 성으로 항산화 활성을 조사하여 대조군과 비교하였다(Fig. \(2 \)). 양이온 라디칸 소거능은 들깨박 \( 13.9 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 농도에서 효소분해물은 \( 67.39 \pm 0.70 \% \) 로 대조군의 \( 48.37 \pm 0.27 \% \) 보다 약 \( 20 \% \) 증가하였으며, 유리 라디칸 소거능은 들깨박 \( 11.1 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 농도에서 효소분해물은 \( 86.52 \pm 0.48 \% \) 로, 대조군의 \( 39.93 \pm 1.02 \% \) 보다 \(2 \)배 이상 증가하였다. 항산화 활성은 효소분해물과 대조군 모두 농도 의존직인 경향을 보였으나 효소분해물에서 항산화 활성이 크게 증가하였다. 풀리페놀 함량과 항산화 활성이 비례한다는 기존의 보고를 참고하면, 본 연구의 결과도 효소처리에 의하여 효소분해물의 풀리페놀 함량( \( 1.64 \mathrm { mg } \mathrm { GAE } / \mathrm { mL } ) \) 이 대조 군 \( (0.69 \mathrm { mg } \mathrm { GAE } / \mathrm { mL } ) \) 보다 \(2 \)배 이상 증가된 것에 기인하는 것으로 판단된다. 또한 효소 처리에 의하여 식물 조직의 파괴 및 배당체 형태로 존재하는 풀리페놀 화합물이 유리형 으로 전환 등에 의하여 풀리페놀 화합물의 추출이 항상되 었다는 보고와 일치하는 결과이다. Jeong 등은 들깨박으로 부터 \(10 \)종의 풀리페놀 화합물을 분리하여 rosmarinic acid와 protocatechuic aldehyde의 DPPH 라디칼 소거활성이 가장 우수 함을 보여주었다. 또한 들깨박에서 분리한 단백질을 단백질 분 해효소로 처리한 가수분해물에서 항산화 활성을 보이는 펩타이드에 관한 보고를 함께 고려하면 본 연구의 효소분해물의 항산화 활성은 풀리페놀 화합문과 Alcalase에 작용으로 생성 된 펩타이드에 기인하는 것으로 사료된다.</p> <h3>들깨박 효소분해물에서 젓산균 배양</h3> <p>들깨박 효소분해물의 미생물 배양 배지로서의 활용 가능성을 조사하기 위하여 본 연구에서 확립된 빙법으로 제조한 들깨박 효소분해물과 효소를 사용하지 않은 추출물(대조군)에 Leuconostoc mesenteroides \( 310-12 \) 균주를 접종하고 \( 36 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 진탕 배양하면서 경시적으로 균의 생육, 적정산도와 \( \mathrm { pH } \) 의 변화를 비교하였다(Fig. \(3 \)). 발효시간에 따른 배양액의 \( \mathrm { pH } \)는 배양 \(9 \)시간까지 효소분해물 배지에서 대조군 보다 빠르게 감소하였으며 낮은 값을 보였다(효소처리군, \( 6.37 \rightarrow 3.94 \); 대조군, \( 6.59 \rightarrow 4.39 \) ). 적정산도는 \( \mathrm { pH } \) 변화와 동일한 경향으로 배양 \(9 \)시간 후 효소분해물 배지에서 \( 0.77 \% \) 까지 증가하였으나, 대조군에서는 \( 0.20 \% \) 로 측정되었다. 또한 효소분해물에서 젖산균은 접종 후 빠르게 생육이 진행되어 배양 \(15 \)시간까지 지속적인 성장을 보였으나, 대조군에서는 접종 후 약 \(6 \)시간의 지연기(lag phase)가 관찰되었으며 배양 \(15 \)시간 후 생육 정도는 유사하였다. 배양 초기의 빠른 성장과 산의 생성은 들깨박의 효소 처리로 환원당과 단백질 함량의 증가에 기인하는 것으로 사료된다. 이상의 결과는 단순 추출물보다 효소분해물이 미생물의 생육에 효과적임을 나타내는 것으로, 홍삼박, 현미, 흑마늘에서 보고된 결과와 매우 유사한 경향이다. 본 연구에서는 들깨박 효소분해물을 특별한 영양 성분의 추가 없이 그대로 미생물 배양 배지로 사용하였는데, 기존의 \( 10 \% \) 탈지분유에 상업용 혼합 젓산균을 \(15 \)시간 베양한 요거트 제조 결과 \( ( \mathrm { pH } 3.9 \), 적정산도 \( 0.93 \%[35] \) 와 산의 생성을 비교해 보아도 들깨박 효소분해물은 미생물 배양 배지로 충분히 활용 가능하다고 판단된다.</p> <h2>초 록</h2> <p>본 연구에서는 들깨(Perilla frutescens)박으로부터 효소분해물을 제조하기 위한 효소를 선별하여 최적의 반응조건을 확립하였다. Alcalase와 Ceremix의 동시 처리가 들깨박의 단백질과 탄수화물의 가용화에 효과적이었으며, 효소 사용량은 들깨박 중량의 \( 2 \%( \mathrm { w } / \mathrm { w } ), \mathrm { pH } \) 는 \( 7.0 \), 반응 시간은 \(2 \)시간이 적당하였다. 최적의 반응조건에서 든깨박을 Alcalase와 Ceremix로 처리한 결과 환원당, 가용성 단백질 및 총 풀리페놀 함량이 크게 증가하였다. 유리 라디칸과 양이온 라디칸에 대한 소거활성으로 확인한 결과 들깨박 효소분해물의 항산화 활성은 대조군에 비해 우수하였다. 또한 젖산균인 Leuconostoc mesenteroides \(310-12 \) 균주를 들깨박 효소분해물에서 배양한 결과 대조군에 비해 생육과 산의 생성이 우수하였다. 결론적으로 들깨박 효소분해물은 항산화 생리활성 소재로서뿐만 아니라 유산균 배양 배지로서도 활용 가능성이 있음을 확인하였다.</p>	[ "본 연구에서는 들깨박 효소분해물의 항산화 활성에 대해 연구하였는데 ABTS 양이온 라디칼 소거 활성과 DPPH 유리 라디칼 소거 활성으로 항산화 활성을 조사하여 대조군과 비교한 결과 항산화 활성은 소분해물에서 항산화 활성이 크게 증가함을 보였다. 효소분해물의 항산화 활성은 풀리페놀 화합문과 Alcalase에 작용으로 생성 된 펩타이드에 기인하는 것을 기존 연구인 풀리페놀 함량과 항산화 활성이 비례관계를 가진다는 것과 들깨박에서 분리한 단백질을 단백질 분해효소로 처리한 가수분해물에서 항산화 활성을 보이는 펩타이드에 관한 보고를 함께 고려함으로 알 수 있다. 들깨박 효소분해물의 젓산균 배양 배지로서의 활용 가능성을 조사하기 위하여 미사용효소 균주를 접종하고 배양하면서, 균의 생육, 적정산도와 \\( \\mathrm { pH } \\) 의 변화를 비교하였다. 들깨박의 효소 처리로 환원당과 단백질 함량의 증가를 보였는데 이는 배양 초기의 빠른 성장과 산의 생성으로 사료된다. 결론적으로 들깨박 효소분해물은 유산균 배양 배지 및 항산화 생리활성에서도 활용 가능성이 있음을 보였다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-0329-413d-8979-3c17fcfb8b14_02	생명LA	비규제 농약 관리를 위한 한국, 유럽, 미국의 농약관리체계 비교분석	<h2>유럽연합의 농약관리체계</h2> <p>유럽연합의 pesticide는 유해생물 또는 질병을 방지, 사멸, 제어하거나 생산, 저장, 유통 과정 중 작물이나 작물제품을 보호하기 위한 것으로, 작물보호제(Plant protection products)와 살생물제(Biocidal products)를 포함한다. 유럽연합의 작물보호제는 주로 농업 분야나 산림, 원예, 생활편의지역, 집 정원 등에서 작물을 보호하기 위해 사용되는 pesticide를 의미하므로, 국내 농약과 유사한 개념이다. 유럽연합은 유럽집행위원회를 주축으로 농약 관련 Regulation, Directive, Council directive를 시행 중이다. 보건식품안전국은 유럽식품안전청과 협력하여 식품 및 사료 중 잔류농도 및 시중 작물보호제 승인 관련 정책 입안 및 시행을 담당하고 있으며, 유럽식품안전청은 식품 위해성 관련 과학적 자문을 담당하고 있다. 특히 식품 중 농약의 최대잔류농도 (Maximum residue levels, MRLs는 과거 사용됐거나 현재 사용되는 1,100 여개 pesticides를 관리하며, 비-특이적 pesticides는 기본값 \( 0.01 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 을 설정하여 규정하고 있다. 환경국은 유럽환경청과 협력하여 작물 보호제의 지속가능한 사용, 종합물관리, 지하수질, 지표수질, 식용수질 관련 정책 입안 및 시행을 담당하고 있으며, 유럽환경청은 환경 정책 입안자 및 대중에 환경 정보 제공을 담당하고 있다. 특히 내륙성 지표수, 해파(transitional waters), 연안수(coastal water), 지하수 보호를 위한 물관리 지침의 부록 Ⅲ 을 통해 유기인계 화합물, 살생물제, 작물보호제를 주요 오염 물질의 지표로 제시하고 있으며, 지하수 보호를 위한 지침의 부록 Ⅰ 을 통해 pesticides 중 활성물질에 대한 지하수질 기준을 \( 0.1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { L } \) (개별물질) 및 \( 0.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { L } \) (총합)로 제시하고 있다 (European Union, 2006b). 또한 지표수질 보호를 위한 지침의 부록 Ⅰ 을 통해 alachlor, atrazine, chlorfenvinphos, chlorpyrifos, cyclodiene pesticides (aldrin, dieldrin, endrin, isodrin), DDT, diuron, endosulfan, fluoranthene, isoproturon, simazine, trifluralin 등의 pesticides에 대한 연평균농도 및 최대허용농도를 제시하고 있으며, 음용, 조리 등의 식용 목적으로 사용되는 수질에 관한 지침의 부록 Ⅰ 을 통해 pesticides의 수치를 \( 0.1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { L } \) (개별물질; 단, aldrin, dieldrin, heptachloro, heptachlor epoxide만 \( 0.03 \mu \mathrm { g } / \mathrm { L } \) ) 및 \( 0.5 \mu \mathrm { g } / \mathrm { L } \) (총합)로 제시하고 있다. 통계청은 시중 작물보호제 통계 관련 정책 입안 및 시행을 담당하고 있다.</p> <h2>미국의 농약관리체계</h2> <p>미국의 pesticide는 연방 살충제 - 살균제 - 살서제법(Federal insecticide, fungicide, and rodenticide act)에 따라 유해생물의 방지, 파괴, 격퇴, 경감 물질 또는 혼합물, 식물생장조절물질, 고엽제, 건조제 용도로 사용되는 물질 또는 혼합물, 질소안정제를 포함한다. 미국은 환경부, 식품의약처, 농무부를 주축으로 농약 관련 law 및 act를 시행 중이다. 환경부는 Safe Drinking Water Act (SDWA), Clean Water Act (CWA), Comprehensive Environmental Response, Compensation, and Liability Act (CERCLA), Pesticide Registration Improvement Extension Act (PRIA3), FIFRA, Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (FFDCA)를 중심으로 지하수먹는물 사무국, 폐수 관리국, 수퍼펀드 정화 및 기술혁신국, 농약프로그램 사무국과 협력하여 먹는물, 지표수 준거치, 토양 screening level 설정, 배출수 관리 우선순위 물질 선정, 농약 등록비, 생산, 사용, 등록, 식품 내 잔류 최대농도 설정을 담당하고 있다. 특히 인체건강 보호를 위한 수질준거치, 담수 및 해수 생태계 보호를 위한 수질준거치(Aldrin 등), 배출수 관련 우선순위물질 목록 (aldrin, dieldrin, chlordane, 4,4-DDT, 4,4-DDE, 4,4-DDD, alpha-endosulfan, beta-endosulfan, endosulfan sulfate, endrin, endrin aldehyde, heptachlor, heptachlor epoxide, alpha-BHC, beta-BHC, gamma-BHC, delta-BHC, toxaphene), 토양 screening level, 먹는물 기준 중 pesticde가 포함되어 있다. 식품의약처는 FFDCA를 중심으로 식품안전 및 응용 영양센터와 협력하여 식품 및 사료 중 농약 감시, 농약 프로그램 운영, 연간보고서, 잔류 모니터링 데이터베이스, 농약 화학물질 용어집, 농약 분석 매뉴얼, 총 식품 연구자료를 담당하고 있으며, 농무부는 FFDCA를 중심으로 농업마켓서비스와 협력하여 육류 및 가금류 농약 감시, 원자재 잔류 농약 모니터링을 담당하고 있다. 특히 코덱스 MRLs에 따라 식품 중 잔류농약을 관리하고 있다.</p>	[ "유럽연합은 주로 농업 분야나 산림, 원예, 생활편의지역, 집 정원 등에서 사용되는 pesticide를 관리하기 위해 Regulation, Directive, Council directive를 시행하고 있으며, 식품 중 농약의 최대잔류농도(MRL)의 기본값을 설정하여 규정하고 있다. 미국은 농약관련 LAW 및 ACT를 환경부와 식품의약처 그리고 농무부를 중심으로 시행 중이다. 식품의약처와 농무부는 FFDCA를 중심으로 식품 연구자료를 담당하고 육류 및 가금류의 농약을 감시하고 여러 기관과 협력하여 원자재의 잔류 농약의 모니터링을 담당하고 있다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-05fe-4168-8a68-879c364acd3f_03	생명LA	‘꼬리겨우살이’(Loranthus tanakae) 전초로부터 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside 의 분리 동정 및 세포독성	<h2>\( \mathrm { AGS } \) 와 \( \mathrm { HepG } 2 \) 세포에 대한 세포독성 실험</h2> <p>위 연구에 대한 재료 및 방법은 이전 실험과 동일하게 실시하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <p>화합물 \(1 \)은 negative FAB-MS에서 \( \mathrm { m/z } ~443 \) \( \mathrm { [M } \)- \( \mathrm { H] } ^ { - } \) 의 분자이 온 peak가 관측되어 분자량을 444로 길정하였다. IR 스펙트럼으로부터 수산기 \( \left (3310 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), 카보닐기 \( \left (1690 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), 이중결합 \( \left (1620 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \)이 있는 것으로 확인되었다. \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)- \( \mathrm { NMR } \)( \(400 \mathrm { MHz } \), \( \mathrm { MeOD } , \delta_ {\mathrm { H } } \)) spectrum에서 세 개의 olefin methine proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } 7.83,1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=16.0 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -4 ; \delta_ {\mathrm { H } } 6.35,1 \mathrm { H } \right . \), d, \( \left .J=16.0 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -5 ; \delta_ {\mathrm { H } } 5.80,1 \mathrm { H } , \mathrm { s } , \mathrm { H } -2 \right ) \)이 관측되었는데, 이 때 \( J=16.0 \mathrm { ~Hz } \)으로부터 trans 구조를 갖는 이중결합이 존재함을 예상하였다. 한 개의 oxygenated methine proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } \right . \) \( 4.23,1 \mathrm { H } , \mathrm { m } , \mathrm { H } -3 ^ {\prime } \) ), 한 개의 oxygenated methylene proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } 3.80,1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=7.2 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -7 ^ {\prime } \mathrm { a } ; \delta_ {\mathrm { H } } ~3.72,1 \mathrm { H } \right . \), d, \( J=7.2 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -7 ^ {\prime } \mathrm { ~b } ) \), 두 개의 methylene proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~2.15 \right . \), \(1 \mathrm { H } \), dd, \( J=13.6,6.8 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -2 ^ {\prime } \mathrm { a } ; \delta_ {\mathrm { H } } ~1.95,1 \mathrm { H } \), overlapped, \( \left . \mathrm { H } -4 ^ {\prime } \mathrm { a } ; \delta_ {\mathrm { H } } ~1.83,2 \mathrm { H } , \mathrm { m } , \mathrm { H } -2 ^ {\prime } \mathrm { b } , 4 { } ^ {\prime } \mathrm { b } \right ) \), 세 개의 methyl proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~2.00,3 \mathrm { H } , \mathrm { s } , \mathrm { H } -6 ; \delta_ {\mathrm { H } } ~1.15,3 \mathrm { H } , \mathrm { s } , \mathrm { H } -9 ^ {\prime } ; \delta_ {\mathrm { H } } ~0.92 \right . \), \( \left .3 \mathrm { H } , \mathrm { s } , \mathrm { H } -10 ^ {\prime } \right ) \) 이 관측되었다 그 중 \( \delta_ {\mathrm { H } } ~2.00 \)에서 관측된 methyl기는 allyl methyl기로 예상하였다. 또한 당에서 유래한 하나의 hemiacetal proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~4.35,1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=8.0 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -1 " \right ) \)과 네 개의 oxygenated methine proton signal \( \left ( \delta_ { H } ~3.34,1 \mathrm { H } \right . \), overlapped, H-3; \( \delta_ {\mathrm { H } } ~3.32,1 \mathrm { H } \), overlapped, H-5; \( \delta_ {\mathrm { H } } ~3.31 \), \(1 \mathrm { H } \), overlapped, H-4; \( \delta_ {\mathrm { H } } ~3.10,1 \mathrm { H } \), dd, \( J=7.6,7.6 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } - \) \( 2) \), 하나의 oxygenated methylene proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~3.86,1 \mathrm { H } \right . \), dd, \( J=12.0,5.6 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -6 " \mathrm { a } ; \delta_ {\mathrm { H } } ~3.67,1 \mathrm { H } \), dd, \( J=12.0,5.6 \) \( \mathrm { Hz } , \mathrm { H } -6 ^ {\prime \prime } b \) )이 관측되었다. 이를 통해 이 화합물을 sesquiterpene monoglycoside로 예상 할 수 있었으며, 당은 육탄당으로 예상하였다. \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } - \mathrm { NMR } \left (100 \mathrm { MHz } , \mathrm { MeOD } , \delta_ {\mathrm { C } } \right ) \) spectrum에서 총 탄소수가 21개임을 확인하였으며, 이를 통해 탄소 수 15 개의 sesquiterpene에 육탄당이 하나 결합되어있는 배당체 임을 확인하였다. 당의 chemical shift \( \delta_ {\mathrm { c } } ~103.1 \left ( \mathrm { C } -1 ^ {\prime \prime } \right ), 78.1 \left ( \mathrm { C } -3 ^ {\prime \prime } \right ), 78.0 \) (C-5"), \( 75.1 \left ( \mathrm { C } -2 ^ {\prime \prime } \right ), 71.7 \left ( \mathrm { C } -4 ^ {\prime \prime } \right ), 62.8 \left ( \mathrm { C } -6 ^ {\prime \prime } \right ) \) 와 anomer proton signal 의 결합정수 \( (J=8.0 \mathrm { ~Hz } ) \)로부터 이 당이 \( \beta \)-glucopyranose임을 확인하였다. 비당부에 있어서 하나의 carboxyl \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~166.4, \mathrm { C } -1 \right ) \), 하나의 olefin quaternary \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~145.3, \mathrm { C } -3 \right ) \), 세 개의 olefin methine \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~132.6, \mathrm { C } -4 ; \delta_ {\mathrm { C } } ~132.2, \mathrm { C } -5 ; \delta_ {\mathrm { C } } ~124.5, \mathrm { C } -2 \right ) \), 두 개의 oxygenated quaternary \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~49.3, \mathrm { C } -1 ^ {\prime } ; \delta_ {\mathrm { C } } ~83.2, \mathrm { C } -8 ^ {\prime } \right ) \), 하나의 oxygenated methine \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~74.0, \quad \mathrm { C } -3 ^ {\prime } \right ) \), 하나의 oxygenated methylene \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . \) 77.2, \( \left . \mathrm { C } -7 ^ {\prime } \right ) \), 하나의 quaternary \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . \) 87.6, \( \left . \mathrm { C } -5 ^ {\prime } \right ) \), 두 개의 methylene \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~42.9, \mathrm { C } -2 ^ {\prime } ; \delta_ {\mathrm { C } } ~42.8, \mathrm { C } \right . \) - \( \left .4 ^ {\prime } \right ) \), 세 개의 methyl \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~20.8, \mathrm { C } -6 ; \delta_ {\mathrm { C } } ~19.7, \mathrm { C } -9 ^ {\prime } ; \delta_ {\mathrm { C } } ~16.3 \right . \), \( \mathrm { C } -10 ^ {\prime } \) ) carbon signal 들을 확인하였다. 부분 구조는 2D-NMR (gCOSY, NOESY, gHSQC and \( \mathrm { gHMBC } \) )를 통해 결정되었다. 인접한 수소와 탄소의 correlation을 보여주는 gHMBC 데이터에서는 두 개의 olefin methine proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~7.83 \right . \), H-4; \( \left . \delta_ {\mathrm { H } } ~6.35, \mathrm { H } -5 \right ) \)이 oxygenated quaternary carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . \) 83.1, C-8')과 cross peak를 보여 하나의 vinyl group이 C-8'에 연결되어 있음을 알 수 있었다. 또한 하나의 olefin methine proton signal \( \left . \delta_ {\mathrm { H } } ~6.35, \mathrm { H } -5 \right ) \)이 olefin quaternary carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~145.3, \mathrm { C } -3 \right ) \)과 cross peak를 보이고, 하나의 olefin methine proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~5.80, \mathrm { H } -2 \right ) \)이 olefin methine carbon signal ( \( \delta_ {\mathrm { C } } \) 132.6, C-4)과 cross peak를 보임에 따라 두개의 olefin methine이 공역화 되어 있음을 알 수 있었다. 하나의 oxygenated methylene proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~3.80, \mathrm { H } -7 ^ {\prime } \mathrm { a } \right ) \)이 각각 oxygenated quaternary carbon \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~49.3, \mathrm { C } -1 ^ {\prime } \right ) \), oxygenated quaternary carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~83.2, \mathrm { C } -8 ^ {\prime } \right ) \), methylene carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~42.8, \mathrm { C } -4 ^ {\prime } \right ) \) 과 cross peak를 보여 oxygenated methylene이 \( \mathrm { C } -5 ^ {\prime } \) 에 연결되어있고, \( O \)-linkage로 \( \mathrm { C } -1 ^ {\prime } \)에 연결되어 있음을 확인하였다. 이를 통해 이 화합물이 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside임을 알 수 있었다. 또한 anomer proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~4.35, \mathrm { H } -1 ^ {\prime \prime } \right ) \)이 oxygenated methine carbon \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~74.0, \mathrm { C } -3 ^ {\prime } \right ) \)과 cross peak를 보임에 따라 \( \beta \)-glucopyranose가 C- \( 3 ^ {\prime } \)에 연결되어있음을 확인하였다. NOESY spectrum에서는 methyl proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~2.00, \mathrm { H } -6 \right ) \)이 olefin methine signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~5.80 ~ \mathrm { H } -2 \right ) \)과 cross peak를 보이지 않음에 따라 C-2와 C-3의 이중결합을 \( E \)구조로 결정하였다. 화합물 1에 대한 \( \mathrm { CD } \) 값을 측정하였으며, 그 결과 \( 263 \mathrm { ~nm } \) 에서 positive cotton effect (CE) 가 나타났으며, \( 246 \mathrm { ~nm } \) 에서 negative \( \mathrm { CE } \) 가 나타났다. 따라서 화합물 1의 절대구조를 같은 구조의 문헌값과 비교해 \( 1 ^ {\prime } R, 3 ^ {\prime } S \), \( 5 ^ {\prime } R, 8 ^ {\prime } S, 2 E, 4 E \) 로 확인하였다. 위의 data들을 종합하여 최종적으로 화합물 1을 \( (1 ^ {\prime } R, 3 ^ {\prime } S \), \( 5 ^ {\prime } R, 8 ^ {\prime } S, 2 E, 4 E) \)-dihydrophaseic acid \( 3 ^ {\prime } \)- \( O \)- \( \beta \)-D-glucopyranoside로 구조 동정 하였다. 이 화합물은 2011년 연꽃의 씨앗으로부터 치음 분리 보고 되었으며, 꼬리겨우살이 \((L. \) tanakae \() \)로부터는 이번 실험에서 처음 분리 되었다. 이 화합물에 대한 활성은 아직까지 보고된 바 없다.</p>	[ "화합물 1은 negative FAB-MS에 의해 분자량을 444로 결정하였으며 IR 스페트럼에 의해 수산기, 카보닐기, 이중결합이 있는 것으로 확인되었다. 또한 이 화합물은 sesquiterpene monoglycoside인 것과 육탄당의 당을 가지고 있다고 예상할 수 있다. 또한 이 화합물의 당이 \\(\\beta\\)-glucopyranose임을 확인하였고 결과적으로 이 화합물은 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside 이다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-05fe-4168-8a68-879c364acd3f_00	생명LA	‘꼬리겨우살이’(Loranthus tanakae) 전초로부터 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside 의 분리 동정 및 세포독성	<h1>서 론</h1> <p>겨우살이란 광합성은 가능하지만 물과 영양분은 숙주 나무로부터 흡수하는 반 기생 식물이다. 겨우살이는 유럽에서 고지혈증, 암, 당뇨병을 치료하는 천연 약재로 사용되어 왔으며, 한방에서 간과 신장, 근골을 강화하는 한약재 '상기생(상기생)'도 이에 속한다. 한국에 자생하는 겨우살이로는 강원도, 경상도, 제주도 지방에서 자생하는 겨우살이(Viscum album var. coloratum), 동백나무겨우살이(Korthalsella japonica), 참나무겨우살이(Loranthus yadoriki) 세 가지와 강원도, 경상도, 제주도 산지의 낙엽활엽수에 기생해서 자라는 비교적 드문 편의 겨우살이인 꼬리겨우살이(Loranthus tanakae)가 있다.</p> <p>꼬리겨우살이는 꼬리겨우살이과(Loranthaceae)에 속하는 낙엽 소관목으로, 그 꽃차례나 열매가 꼬리처럼 길게 달리는 겨우살이의 종류라는 의미로 이름 지어졌다. 꼬리겨우살이는 \( 20 \sim 40 \mathrm { cm } \) 정도로 생장하며 꽃은 \( 5 \sim 6 \)월 개화한다. 꽃의 크기는 \( 3 \sim 5 \mathrm { cm } \) 정도로 황록색을 띄며 향은 매우 미약하다. 꽃잎은 타원형 또는 좁은 난형으로 \( 3 \sim 6 \)개이다. \( 10 \sim 11 \)월에는 진한 노란색으로 \( 0.5 \mathrm { ~cm } \) 정도의 구형의 열매가 맺히는데, 이 열매는 단 맛으로 점액질의 과육에 싸여있다. 다른 겨우살이들에 비해 열매가 비교적 더 작고 진한 노란색이며 여러 개가 길게 늘어져 달리는 점과 낙엽성이라 겨울에 잎이 없다는 점에서 다른 겨우살이들과 차이를 보인다. 한방에서 사용되는 '상기생'은 바로 이 꼬리겨우살이 \( (L. \) tanakae)의 잎과 줄기이다. 다양한 한방학적, 약리학적 활성에도 불구하고 꼬리겨우살이의 활성으로는 미백, 항산화, 세포독성만이 보고되어 있으며, 분리 관련 논문은 \( 4 \)종의 flavonol rhamnoside를 분리한 문헌이 유일하다. 따라서, 꼬리겨우살이를 가지고 생리활성물질을 분리하고, 이에 대한 활성을 검증해 활용방안을 모색해보고자 본 연구를 시작하였다. 현재까지 저자 등은 꼬리겨우살이로부터 \( 10 \)종의 flavonoid, \( 2 \)종의 lignan, \( 1 \)종의 phenylethanoid 화합물을 분리 동정, 보고한 바 있다. 이번 실험에서는 식물에서 잘 보고되지 않은 화합물인 clclofarnesane sesquiterpene glucoside을 분리 동정하였기에 이에 대하여 보고하고자 한다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험에서 사용한 꼬리겨우살이 \( (L. \) tanakae)는 강원도 정선의 농장에서 구입하였으며, 우석대학교 김대근 교수가 동정하였다. 표본시료(KFMMEL- \( 201403 \))는 경희대학교 천연물화학실험실에 보관되어 있다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>시약 및 기기는 이전 실험과 동일하게 사용하였다. CD 곡선은 Jasco spectropolarimeter type J- \( 715 \) (scan range: \( l = 200 \) - \( 450 \mathrm { ~nm } \), cell length: \( 0.1 \mathrm { ~cm } ) \)로 측정하였다.</p>	[ "꼬리겨우살이는 한방에서 사용되는 '상기생'이며, 강원도, 경상도, 제주도 지방에서 낙엽활엽수에 기생해서 자라는 비교적 드문 편의 겨우살이이다. 꽃은 황록색을 띄며 향은 미약하고, 열매는 노란색으로 구형의 열매가 맺힌다. 꼬리겨우살이는 미백, 항산화, 세포독성 활성이 보고되어 있으며, flavonoid, lignan, phenylethanoid 화합물을 분리 동정하였다. 본 실험에서 clclofarnesane sesquiterpene glucoside을 분리 동정했다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-05fe-4168-8a68-879c364acd3f_04	생명LA	‘꼬리겨우살이’(Loranthus tanakae) 전초로부터 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside 의 분리 동정 및 세포독성	<p>Sesquiterpene glycoside 화합물들의 활성으로는 주로 간보호, 항간독성, 세포독성 활성이 보고되어 있다. 문헌 검색을 통하여 sesquieterpene 구조에서는 당이 결합 되어 있지 않을 때 보다 당이 결합 되어 있을 더 높은 수준의 세포독성 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 이에 따라 화합물 1에 대한 세포독성 활성을 기대할 수 있다고 판단하여 활성 실험을 진행하였다. 화합물 1의 Caucasian gastric adenocarcinoma cells \( ( \mathrm { AGS } ) \)와 Hepatocyte carcinoma cells (HepG2)에 대한 세포독성은 MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl-tetrazolium bromide] colorimetric방법으르 측정하였다. 그 결과, 화합물 1은 양 세포에 대하여 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 이상에서 농도 의존적으로 유의한 세포독성을 보이는 것으로 확인되었다(Fig. 2).</p> <p>결론적으로, 꼬리겨우살이 ( \( L. \) tanakae \() \) 전초로부터 \( \mathrm { SiO } _ { 2 } , \mathrm { ODS } \), Sephadex LH-20을 이용한 column chromatography를 반복하여 1종의 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside를 분리하였다. 또한 1D-, 2D-NMR, IR, FAB-MS, CD data를 분석하여 화합물의 구조를 동정하였다. 화합물 1은 AGS와 HepG2 cell에 대하여 농도의존적으로 유의한 정도의 세포독성을 보였다. 또한 꼬리겨우살이에서 분리한 flavonol rhamnosides 4종의 암세포에 대한 세포독성 실험 결과와 비교하였을 때, 해당 문헌의 flavonol rhamnosides 4종은 A549 (non small cell lung), SK-OV-3 (ovary), SK-MEL-2 (skin), XF498 (central nerve system), HCT-15 (colon) cultured human tumor cell lines에 대하여 유의한 정도의 세포독성을 보였고, 화합물 1은 \( \mathrm { AGS } \) 와 HepG2 cell에 대하여 농도의존적으로 유의한 정도의 세포독성을 보였으므로 시로 다른 암세포에 대해 비슷한 정도의 세포독성을 가짐을 확인할 수 있었다.</p> <h1>초 록</h1> <p>꼬리겨우살이(Loranthus tanakae) 전초를 \( 80 \% \mathrm { ~MeOH } \) 수용액으로 4회 반복 추출한 뒤, 감압 농축한 추출물을 ethyl acetate (EtOAc), \( n \)-butyl alcohol \((n \)- \( \mathrm { BuOH } ) \)과 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)층으로 계통 분획을 실시하였다. \( n \)- \( \mathrm { BuOH } \) 분획에 대하여 silica gel \( \left ( \mathrm { SiO } _ { 2 } \right ) \), octadecyl silica gel (ODS), Sephadex LH-20 column chromato-graphies를 반복실시하여 1 종의 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside 화합물을 분리 및 정제하였다. 스펙트럼 데이터를 분석하여 입체 구조를 포함한 화합물의 구조를 \( \left (1 ^ {\prime } R, 3 ^ {\prime } S, 5 ^ {\prime } R, 8 ^ {\prime } S, 2 E, 4 E \right ) \)-dihydrophaseic acid 3'-O- \( \beta \)-D-glucopyranoside로 구조 동정 하였다. 이 화합물은 이번 실험을 통하여 꼬리겨우살이로부터는 최초로 분리되었다. 분리한 단일 물질은 AGS (Caucasian gastric adenocarcinoma cells)와 Hepatocyte carcinoma cells에 대하여 \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 이상에서 농도 의존적으로 유의한 정도의 세포독성을 보이는 것이 확인되었다.</p>	[ "꼬리겨우살이 전초로부터 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside 하나를 분리하여 구조를 동정하였고 분리한 flavonol rhamnosides 4종의 암세포에 대한 세포독성 실험 결과와 비교하였을 때 유의한 정도의 세포독성을 보였고, 화합물 1은 AGS와 HepG2 cell에 대하여 농도의존적으로 유의한 정도의 세포독성을 보였으므로 다른 암세포에 대해 비슷한 정도의 세포독성을 가짐을 확인할 수 있었다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-05fe-4168-8a68-879c364acd3f_01	생명LA	‘꼬리겨우살이’(Loranthus tanakae) 전초로부터 cyclofarnesane sesquiterpene glucoside 의 분리 동정 및 세포독성	<h2>추출 및 분리</h2> <p>건조한 '꼬리겨우살이' 전초 \( 5.5 \mathrm { ~kg } \) 을 \( 80 \% \) methanol \( ( \mathrm { MeOH } ) \) 수용액 \( (20.5 \mathrm { ~L } ) \)으로 실온에서 24시간씩 4회 반복 추출하였다. 얻어진 여액을 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 감압농축하여 \( \mathrm { MeOH } \) 추출물 \( (629 \mathrm { ~g } ) \)을 얻었다. 얻어진 \( \mathrm { MeOH } \) 주출물은 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } ~(1.5 \mathrm { ~L } ) \)와 ethyl acetate(EtOAc, \(1.5 \mathrm { ~L } \times 5) \)로 분배 추출하였고, 다시 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 층을 \( n \)-butyl alcohol\( ( n \)-\( \mathrm { BuOH } , ~1.3 \mathrm { ~L } \times 3) \)로 분배 추출하였다. 각층을 \( 40 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 감압농축하여 \( \mathrm { EtOAc } \) 분획(LTE, \( 302 \mathrm { ~g } \)), \( n \)-\( \mathrm { BuOH } \) 분획(LTB, \( 79 \mathrm { ~g } \)) 및 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) 분획(LTW, \( 248 \mathrm { ~g } \))을 얻었다. \( n \)-\( \mathrm { BuOH } \) 분획(LTB, \( 46 \mathrm { ~g } ) \)에 대하여 silica gel \( \left ( \mathrm { SiO } _ { 2 } \right ) \) column chromatography(c.c.) ( \( \phi ~10.0 \times 16.0 \mathrm { ~cm } , ~ \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)- \( \mathrm { MeOH } \)- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)= \(16:3:1 \) \( \rightarrow \) \( 14:3:1 \) \( \rightarrow \) \( 12:3:1 \) \( \rightarrow \) \( 10:3:1 \) \( \rightarrow \) \( 8:3:1 \) \( \rightarrow \) \( 6:4:1 \), 각 \( 5.3 \mathrm { L } \))를 실시하여, 총 11개의 분획(LTB-1~LTB-11)을 얻었다. 그 중에서 LTB-7 분획[ \( 1.6 \mathrm { g } \), elution volume/total volume \( ( \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } ) \) \( 0.804 \)- \( 0.810 \)]에 대하여 octadecyl \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \) (ODS) c.c. ( \( \phi ~5.0 \times 7.0 \mathrm { ~cm } , ~ \mathrm { MeOH } \)- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)= \( \ 1:1 \), \( ~2.2 \mathrm { ~L } \) )를 실시하여, 총 7개의 분획(LTB-7-1~LTB-7-7)을 얻었다. 그 중에서 LTB- 7-1 분획\( [869.0 \mathrm { mg } , \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } ~0.000 \)- \( 0.140] \)에 대하여 Sephadex. LH-20 c.c. \( ( \phi ~3.0 \times 50 \mathrm { ~cm } , 100 \% ~ \mathrm { MeOH } , 0.2 \mathrm { ~L } ) \)를 실시하여, 총 11개의 분획(LTB-7-1-1~LTB-7-1-1-11)을 얻었다. 그 중에서 LTB-7-1-1 분획 \( [50.0 \mathrm { mg } , \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } ~0.000 \)- \( 0.210] \)에 대하여 \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \) c.c. ( \( \phi ~1.5 \times 15.0 \mathrm { ~cm } , ~ \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)- \( \mathrm { MeOH } \)- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)= \( 7:3:1 \), \( ~0.4 \mathrm { ~L } \))를 실시하여, 화합물 1[(\(1'R, 3'R, 5'R, 8'S, 2Z, 4E\))-dihydrophaseic acid, LTB-7-1-1-4, \(7.0~ \mathrm { mg } \), \( \mathrm { V_e / V_t } \) \(0.350 \)- \(0.445 \), \( \mathrm { R_f } = 0.30 \) (Kiesel gel \(60 \) \( \mathrm { F_ { 254 } } \) \( \mathrm { CHCl_3 } \)- \( \mathrm { MeOH } \)- \( \mathrm { H_2 } \mathrm { O } \)= \(5:3:1 \)), TLC \( \mathrm { R_f } \)= \(0.80 \) (RP-18 \( \mathrm { F_ { 254S } } \), \( \mathrm { MeOH } \)- \( \mathrm { { H_2 } O } \)= \(1:3 \))을 분리하였다.</p>	[ "본 논문은 건조한 꼬리겨우살이 전초 \\( 5.5 \\mathrm { ~kg } \\)을 \\( 80 \\% \\) methanol \\( ( \\mathrm { MeOH } ) \\) 수용액 \\( (20.5 \\mathrm { ~L } ) \\)으로 실온에서 24시간씩 4회 반복해서 추출한 후 여액을 \\( 40 ^ {\\circ } \\mathrm { C } \\)에서 감압농축해 \\( \\mathrm { MeOH } \\)를 추출했다. 확보한 \\( \\mathrm { MeOH } \\) 주출물은 \\( \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { O } ~(1.5 \\mathrm { ~L } ) \\)와 ethyl acetate로 분배 추출했고 다시 \\( \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { O } \\)층을 \\( n \\)-butyl alcohol로 분배 추출했다." ]
55e-0c9-e76428ae-8988-4360-bc09-0936ef89c280_00	생명LA	Bacillus amyloliiquefaciens AP01 균주에 의한 사이퍼메트린의 생물학적 분해 특성	<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>사이퍼메트린(cypermethrin)의 생물학적 분해를 위한 미생물의 분리.</h2> <p>부산 인근의 경작지 토양 및 연안 퇴적물로부터 샘플을 채취하였다. 샘플을 사이퍼메트린(cypermethrin)이 함유된 MSM 배지에서 순차적으로 배양한 후, 고체 배지에서 콜로니를 도출하였다. 도출된 콜로니들 중 재차 사이퍼메트린(cypermethrin)이 \( 50 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 로 포함된 MSM배지에서 \(5 \) 일간 배양 후 배양액 속에 잔류 사이퍼메트린(cypermethrin)의 농도를 측정하여 초기 첨가한 농도에 비하여 감소된 경향을 나타내는 콜로니들 중에서 강한 활성을 나타내는 콜로니를 선정하여 AP \(01 \)이라고 명명하였다.</p> <h2>16S rDNA 염기서열을 활용한 분리 균주 동정.</h2> <p>분리 균주 AP \(01 \) 의 \( 16 \)S rDNA 를 알려진 대장균의 \( 16 \)S rDNA 염기서열을 바탕으로 제작한 프라이머를 활용하여 PCR을 통하여 증폭하였다. 얻어진 \( 16 \)S rDNA 염기서열을 GenBank의 기존에 보고된 \( 16 \)S rDNA 들과 비교하고, 유전학적 유연관계를 ClustalX program을 활용하여 phylogenetic tree로 나타내었다. AP \( 01 \) 균주의 \( 16 \)S rDNA 서열은 Bacillus amyloliquefaciens (AF \( 489591 \))와 \( 99 \% \) ( \(1514/1526 \))의 상동성, B. vallismortis \( ( \mathrm { AB } 021198) \)와 \( 99 \%(1525 / 1530) \) 의 상동성, B. subtilis (X \( 60646 \))와 \( 99 \% \) ( \(1413 / 1430) \), (AB \(042061) \)와 \( 99 \% \) \((1535 / 1544) \) 그리고 (AB \(110598) \)와 \( 99 \% \) ( \( 1534/1542 \))의 상동성, B . mojavensis (AB \(021191 \))와 \( 99 \% \) ( \( 1515 / 1526) \), B. atrophaeus (AB \( 021181 \))와 \( 99 \% \) \((1504 / 1515) \)의 상동성, B. licheniformis (X \( 68416 \))와 \( 98 \% \) \((1517 / 1545) \) 의 상동성과 B. pumilus (X \( 60637 \))와 \( 94 \% \) \((1352 / 1432) \)의 상동성을 각각 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 분석들로 미루어 보아 분리균주 AP \( 01 \)은 Bacillus amyloliquefaciens에 속하는 것을 확인 할 수 있었으며, 분리 균주를 Bacillus amyloliquefaciens AP \( 01 \)이라고 명명하였다.</p>	[ "부산 인근에서 채취한 샘플을 통해, 사이퍼메트린이 포함된 배지에서 배양 후 강한 활성을 나타내는 콜로니를 선정하여 AP \\(01 \\)로 명명하였다. AP \\(01 \\) 균주의 \\( 16 \\)S rDNA를 PCR 증폭하였으며, Bacillus amyloliquefaciens 와의 상동성을 나타냈다. 이를 통해 분리된 균주 AP \\(01 \\)이 Bacillus amyloliquefaciens에 속함을 확인하고 Bacillus amyloliquefaciens AP \\( 01 \\)이라 명명하였다." ]
55e-0c9-e76428ae-8988-4360-bc09-0936ef89c280_01	생명LA	Bacillus amyloliiquefaciens AP01 균주에 의한 사이퍼메트린의 생물학적 분해 특성	<h2>탄소원이 분리 균주 AP01이 사이퍼메트린(cypermethrin)의 생물학적 분해에 미치는 영향.</h2> <p>다른 모든 실험 조건은 동일하지만 하나의 인자만 변화를 주어서 실험하는 one factor at a time (OFAT)법을 활용하여 분리 균주 AP01이 사이퍼메트린 (cypermethrin)의 생물학적 분해에 영향을 미치는 탄소원에 대한 실험을 수행하였다. 탄소원의 종류로는 maltose, galactose, glucose, sucrose, lactose, carboxy methyl cellulose (CMC), soluble starch와 colloidal chitin을 각각 사용하였으며, 다른 인자들은 상기 실험조건과 동일하며, 선별된 탄소원들만 최종 \( 2 \% \) 가 되게 배지에 첨가하였다. \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) , \(180 \mathrm { rpm } \) 에서 \( 5 \)일 동안 배양한 후, 사이퍼메트린(cypermethrin) 분해율을 조사하였다.Glucose를 탄소원으로 이용하였을 때 \( 60.25 \% \) 의 분해율을 나타내었으며, sucrose는 \( 58.73 \% \), maltose는 \( 55.33 \% \) 의 분해율을 나타내었다. 기타 다른 탄소원을 사용하였을 때는 \( 45 \% \) 전후의 사이퍼메트린(cypermethrin) 분해 활성을 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과는 분리 균주 AP \(01 \)의 경우, 사이퍼메트린(cyperemthrin)의 생물학적 분해를 위하여 사이퍼메트린 (cyperemthrin)과 더불어 glucose를 추가하였을 때 보다 향상된 분해율을 나타내는 것으로 판단된다. 유사한 결과는 Cycon 등 ( \(2009 \))과 Chen 등( \(2012 \))에 의해서 보고 되었다.</p> <h2>질소원이 분리 균주 AP \( 01 \)이 사이퍼메트린(cypermethrin)의 생물학적 분해에 미치는 영향.</h2> <p>다른 모든 실험 조건은 상기 분석 방법과 동일하지만 질소원의 종류만 변화를 주어서 분리 균주 AP \( 01 \)이 사이퍼레트린 (cypermethrin)의 생물학적 분해에 영향을 미치는 질소원에 대한 실험을 수행하였다. 질소원의 종류로는 ammonium nitrate, casamino acid, casein, peptone, skim milk, tryptone, urea와 yeast extract를 각각 최종 \( 0.5 \% \) 가 되게 첨가하였다. \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \) , \( 180 \mathrm { rpm } \) 에서 \( 5 \)일 동안 배양한 후, 사이퍼메트린 (cypermethrin) 분해율을 조사하였다. 분석에 사용되어진 다양한 질소원들의 경우, 대체로 \( 45 \% \) 전후의 분해율을 나타내었다. 이러한 결과로 보아 분리 균주 \( \mathrm { AP } 01 \) 이 사이퍼메트린 (cypermethrin)의 생물학적 분해 활성에 뚜렷한 영향을 미치지는 못하는 것으로 판단된다.</p> <p>상기의 실험 결과들을 종합해 보면 분리 균주 Bacillus amyloliquefaciens AP01는 피레스로이드(pyrethroid) 계열 살충제중의 하나인 사이퍼메트린(cypemethrin)의 생물학적 분해를 위한 대표 미생물로 그 가능성을 확인 하였으며, 토양 및 농산물에 존재하는 잔류 농약 감소를 비롯하여 안전한 먹거리 확보에 크게 기여 할 것으로 판단된다.</p>	[ "다른 모든 실험 조건은 동일하지만 하나의 인자만 변화를 주어서 실험하는 one factor at a time (OFAT)법을 활용하여 분리 균주 AP01이 사이퍼메트린 (cypermethrin)의 생물학적 분해에 영향을 미치는 탄소원에 대한 실험을 수행하였는데 탄소원의 종류로는 maltose, galactose, glucose, sucrose, lactose, carboxy methyl cellulose (CMC), soluble starch와 colloidal chitin을 각각 사용하였으며, 다른 인자들은 상기 실험조건과 동일하며, 선별된 탄소원들만 최종 \\( 2 \\% \\) 가 되게 배지에 첨가하였다." ]
55e-0c9-7eae53ee-b3af-4c3e-91ec-46401d6bef08_00	생명LA	율무근의 식물화학적 성분 연구 및 Tyrosinase 저해 활성	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에서 사용한 율무 (C. lachrymal-jobi var. ma-yuen) 뿌리를 비롯한 각종 부위의 시료는 연천군 농업기술센터로부터 제공받아 실험에 사용하였으며, 표본(G54)은 (재) 경기도경제과학 진흥원 천연물연구팀에 보관하고 있다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>비선광도는 P-2000 digital polarimeter (JASCO, Tokyo, Japan)를 사용하여 측정하였다. NMR은 Bruker Ascend Ⅲ 700 (700 \( \mathrm { MHz } \) Cryo Probe) spectrometer (Bruker Biospin, Rheinstetten, Germany)를 이용하여 측정하였으며, ESI-MS는 Finnigan TSQ Quantum mass spectrometer (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)를 사용하였고, HRESI-MS는 AB SCIX TripleTOF 5600 + mass spectrometer (AB SCIEX, Framingham, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. MPLC와 preparative HPLC는 Combi Flash Rf (Teledyne ISCO, Lincoln, NE, USA)과 Shimadzu system (LC-8A pump, SPD-20A UV/VIS detector, Kyoto, Japan)을 각각 사용하였다. 분석용 HPLC는 Waters (Waters Co., Milford, MA, USA)의 alliance 시스템(Waters 2998 PDA, Waters e2695 separation modules)을 사용하였다. TLC plate 는 Merck의 Kiesel gel \( 60 \mathrm { ~F } _ { 254 } \) \((0.25 \mathrm { ~mm } \), Darmstadt, Germany) 또는 RP- \( 18_ { 254 \mathrm { s } } \) \( (0.25 \mathrm { ~mm } ) \) 를 사용하였다. 발색시약으로는 \( 10 \% \) vanillin/ \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \) (in \( \mathrm { EtOH } \)) 시약을 사용하였으며, UV의 검색은 254 와 \( 365 \mathrm { ~nm } \) 에서 확인하였다. 추출, 분획 및 MPLC에 사용한 모든 용매는 1급 시약을 사용하였고, preparative HPLC에 사용된 acetonitrile (Honeywell B&J, Muskegon, MI, USA)은 HPLC급 용매(99.9 \( \% \))로 사용하였다. 물은 초순수제조장치 (Cascada \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) RO water, Pall Corporation, Washington, NY, USA)를 이용하여 3차 증류수를 사용하였다. 또한, Tyrosinase inhibitions assay는 L-tyrosine, mushroom tyrosinase와 arbutin (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 사용하였 고, potassium phosphate buffer 제조를 위해 monobasic potassium phosphate \( \left ( \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } \right ) \) 와 dibasic potassium phosphate \( \left ( \mathrm { KH } _ { 2 } \mathrm { PO } _ { 4 } \right ) \) (Sigma)를 사용하였으며, ELISA reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 \( 490 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p>	[ "본 실험에서는 연천군 농업기술센터와 (재) 경기도경제과학 진흥원 천연물연구팀에서 제공받은 율무 뿌리 등 각종 부위의 시료를 사용하였으며, P-2000 digital polarimeter, Bruker Ascend Ⅲ 700 spectrometer, Finnigan TSQ Quantum mass spectrometer를 이용하여 비선광도, NMR, ESI-MS를 측정하였다." ]
55e-0c9-7eae53ee-b3af-4c3e-91ec-46401d6bef08_01	생명LA	율무근의 식물화학적 성분 연구 및 Tyrosinase 저해 활성	<h2>추출 및 분리</h2> <p>건조 율무 (C. lachrymal-jobi var. ma-yuen) 뿌리, 줄기, 잎, 껍질, 미강에 대하여 각각 \( 20 \mathrm { ~g } \) 의 시료에 \( 70 \% \) 에탄올로 추출하여 여과, 농축, 동결건조 후 tyrosinase 억제 활성을 측정하였으며, 활성이 우수한 율무 뿌리 \( (1.9 \mathrm { ~kg } ) \) 을 \( 70 \% \) 에탄올로 추출하여 에탄올 추출물 \( (333 \mathrm { ~g } ) \) 을 얻었다. 이를 증류수 현탁 후 \( n \) -hexane, \( \mathrm { CH } _ { 2 } \mathrm { Cl } _ { 2 } \), \( \mathrm { EtOAc } \), 수포화 \( \mathrm { BuOH } \) 로 용매분획을 반복 실시하였으며, 각각 \( n \)-hexane 분획 \( (14.3 \mathrm { ~g } ), \mathrm { CH } _ { 2 } \mathrm { Cl } _ { 2 } \) 분획 \( (5.1 \mathrm { ~g } ) \), \( \mathrm { EtOAc } \) 분획 \( (5.5 \mathrm { ~g } ) \), 수포화 \( \mathrm { BuOH } \) 분획 \( (28.9 \mathrm { ~g } ) \) 그리고 물 분획 \( (280 \mathrm { ~g } ) \) 을 얻었다. 각 분획물을 \( 100 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 의 농도로 stock solution을 제조하여 tyrosinase 저해 활성을 검색한 결과 \( \mathrm { CH } _ { 2 } \mathrm { Cl } _ { 2 } \) 분획과 \( \mathrm { EtOAc } \) 분획이 저해활성을 나타내었으며, 이에 활성이 우수한 \( \mathrm { EtOAc } \) 가용분획으로부터 성분분리를 시도하였다. \( \mathrm { EtOAc } \) 가용분획 \( (5 \mathrm { ~g } ) \) 에 대하여 증류수- \( \mathrm { MeOH } \) 혼합용매를 이동상으로 Diaion HP-20 레진을 이용한 컬럼크로마토그래피를 수행하여 7개의 소분획(G54-5-1 7)을 얻었다. 소분획 G54-5-3에 대하여 acetonitrile과 증류수를 이동상으로 역상 컬럼을 이용한 MPLC (RediSep \( ^ {\circledR } \) Rf \( 130 \mathrm { ~g } \) C18 Reverse Phase, \( 75 \mathrm { ~mL } / \mathrm { min } , 5 \) 에서 \( 50 \% \) acetonitrile, \( 100 \mathrm { ~min } ) \) 를 수행하여 8개의 분획(G54-8-1 8)으로 나누었다. 반복된 preparative HPLC (column: YMC-Pack ODS-A, \( 5 \mu \mathrm { m } , 250 \times 10 \mathrm { ~mm } \) I.D., \( 12 \mathrm { ~mL } / \mathrm { min } \), 증류수-acetonitrile, \( 95: 5 \) 에서 \( 7:3 \), \( 50 \mathrm { ~min } \) )를 수행하여 소분획 G5481로부터 화합물 3 (2.4 mg)과 5 (1.5 mg)를 얻었으며, G54-82로부터 화합물 1 \( (4.6 \mathrm { mg } ) \), 2 \((3.5 \mathrm { mg } ) \) 및 5 \((4.3 \mathrm { mg } ) \) 를 각각 분리 정제하였다. 화합물 6 \(7.5 \mathrm { mg } ) \) 은 G 54-8-5에 대하여 preparative HPLC (column: YMC-Pack ODS-A, \( 5 \mu \mathrm { m } , 250 \times 10 \mathrm { ~mm } \) I.D., \( 12 \mathrm { ~mL } / \) min, 증류수-acetonitrile, 90:10에서 50:50, \( 30 \mathrm { ~min } \) )를 수행하여 분리하였다.</p>	[ "각 분획물을 \\(100 \\mathrm{mg/mL}\\)의 농도로 주사액용액을 만들어 tyrosinase 저해 활성을 조사한 결과, \\(\\mathrm{CH_2Cl_2}\\) 분획과 \\(EtOAc\\) 분획이 저해 활성을 나타내었다. 이에 따라 활성이 뛰어난 \\(EtOAc\\) 가용분획으로부터 성분을 분리하기로 결정하였다. lachrymal-jobi var. ma-yuen)의 뿌리, 줄기, 잎, 껍질, 미강에 대해 각각 \\(20 \\mathrm{\\mu g}\\)의 시료를 \\(70\\%\\) 에탄올로 추출하여 여과, 농축, 동결건조한 후 tyrosinase 억제 활성을 측정하였다. 그 결과, 활성이 우수한 율무 뿌리 (\\(1.9 \\mathrm{kg}\\))를 \\(70\\%\\) 에탄올로 추출하여 에탄올 추출물 (\\(333 \\mathrm{g}\\))을 얻었다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1456-4a7a-bf57-ca8c1e2971d6_00	생명LA	미생물 공법에 의한 매립가스 황화수소 제거 및 바이오황 생산	<h1>1. 서 론</h1> <p>매립지 내부의 생물화학적 분해작용에 의하여 발생하는 매립가스는 보통 \( 40 \sim 60 \% \)의 메탄 \( \left ( \mathrm { CH } _ { 4 } \right ) \) 및 \( 30 \sim 50 \% \)의 이산화탄소 \( \left ( \mathrm { CO } _ { 2 } \right ) \)가 주 성분이며, 그 외 질소 \( \left ( \mathrm { N } _ { 2 } \right ) 0 \sim 10 \% \), 산소 \( \left ( \mathrm { O } _ { 2 } \right ) 0 \sim 2 \% \), 기타 소량의 황화수소 \( \left ( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \right ) \), 암모니아 \( \left ( \mathrm { NH } _ { 3 } \right ) \), \( \mathrm { VOC } \)(volatile organic compounds) 등으로 구성되어 있다. 이에 따라 많은 매립장에서는 지구온난화 방지 및 신재생에너지의 확보를 위해 매립가스내 \( \mathrm { CH } _ { 4 } \)를 발전 등의 에너지원으로 이용하고 있다. 그러나 건설폐기물이 생활 폐기물과 함께 매립될 경우 시멘트성분에 포함된 석고로 인해 황산염환원세균에 의한 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \)가 발생하게 되며, 심할 경우 수만 \( \mathrm { ppm } \)의 농도를 보이기도 한다. 이러한 고농도 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \)가 포함된 매립가스는 특유의 악취발생과 직접적인 건강상의 피해뿐만 아니라 매립가스 이용시설의 부식과 연소 후 \( \mathrm { SO } _ { 2 } \)의 발생 등 각종 문제를 유발하기 때문에 전처리가 필요하다.</p> <p>\( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \)를 포함한 산성가스의 제거를 위해 현재 가장 많이 사용되고 있는 전처리 공법으로는 Table \( 1 \)과 같이 천연가스 정제, 정유사 탈황 등 대규모 공정에 사용되는 Amine 공정과 Claus 공정이 있고, 이 외에 포집된 산성가스 수용액에 적용하는 철-킬레이트 공법, 수산화철에 의한 건식탈황 공법, 미생물을 이용하는 생물학적 탈황공법 등이 있다. 생물학적 탈황공법의 일종인 THIOPAQ 공법은 스크러버를 통해 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \)를 \( \mathrm { HS } ^ { - } \)로 이온화시킨 후 박테리아를 이용하여 원소상태의 바이오황(bio-sulfur)으로 전환시키는 공정으로서, 단순한 처리공정, 높은 처리율, 화학물질 사용의 최소화, 광범위한 적용 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \) 농도 \( \left ( 100 \mathrm { ppmv } \sim 100 \mathrm { vol. } \% \right ) \) 및 압력범위 \( 0 \sim 1,300 \mathrm { psi } \), 상온에서의 처리, 바이오황의 생산 등 기존의 화학적 공정에 비하여 여러 장점을 가지고 있다. \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \) 제거공법에 따라서는 고순도의 황이 생산가능한데, 국내의 경우 대부분 정유사에서 대량 생산된 것(화확황)으로서 황산 제조, 고무 배합제, 농업용 자재 등으로 사용되고 있다. 이에 비하여 THIOPAQ 공정을 통해 생산되는 바이오황은 생산량은 적으나 화학황보다 입자 크기가 작고 약알카리성이며, 친수성으로 화장품, 살충제, 농약, 비료 등의 고부가 제품으로 광범위하게 사용될 수 있는 잠재력을 가지는 것으로 보고되고 있다.</p>	[ "이러한 고농도 \\( \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { S } \\)가 포함된 매립가스는 특유의 악취발생과 직접적인 건강상의 피해뿐만 아니라 매립가스 이용시설의 부식과 연소 후 \\( \\mathrm { SO } _ { 2 } \\)의 발생 등 각종 문제를 유발하기 때문에 전처리가 필요한데 여러 공정 중 THIOPAQ 공정을 통해 생산되는 바이오황은 생산량은 적으나 화학황보다 입자 크기가 작고 약알카리성이며, 친수성으로 화장품, 살충제, 농약, 비료 등의 고부가 제품으로 광범위하게 사용될 수 있는 잠재력을 가지는 것으로 보고되고 있다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1456-4a7a-bf57-ca8c1e2971d6_01	생명LA	미생물 공법에 의한 매립가스 황화수소 제거 및 바이오황 생산	<p>그러나 이러한 여러 장점과 가능성을 가지고 있는 THIOPAQ 공정은 다른 생물학적 처리공법과 마찬가지로 문제발생 후 정상 회복이 쉽지 않다는 단점이 있기 때문에 유입 매립가스내 황 부하의 변동에 따른 미생물학적 내부 메커너즘의 유지관리가 매우 중요하다. 즉, 유입유량 밎 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \) 농도에 의해서 결정되는 황부하(S-Load)의 급격한 변화에 효과적으로 대응하지 못하면 미생물의 사멸, 거품 형성 등에 의하여 안정된 생물학적 황 전환이 이루어지지 못하고, 부가적인 화학적 반응에 의하여 시스템의 붕괴를 초래할 수 있다. 또한 생산된 바이오황의 품질은 고부가 이용을 위해 필수적이고, 이는 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \) 전처리 공정의 운전방식에 의해 크게 영향을 받는다. 따라서 안정적인 공정을 유지하고 처리효율을 높이면서 고품질의 바이오황 생산을 위해서는 처리시설 단위 공정 사이의 균형유지를 위한 최적운전 요소와 조건을 찾아 적용해야하며, 이는 문헌이나 메뉴얼에서 게시하는 일반적인 공정설계나 운전지표 값만으로는 얻어질 수 없는 것이다.</p> <p>본 연구는 국내 최대 규모의 매립장에 THIOPAQ 시설을 설치한 후 약 \( 2 \)년간의 운전을 통하여 매립가스내 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \)의 효과적인 전처리와 생산된 바이오황의 품질을 높일 수 있는 최적의 공정지표별 운전조건을 연구하였다. 특히 대규모 매립장에서 발생하는 다량의 매립가스를 대상으로 본 공법을 적용하여 연구한 경우로는 세계 최초이므로, 향후 국내외 매립가스 내 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \)의 효과적 제거를 통한 각종 에너지원으로서의 활용도를 높이고 생산된 황의 고부가 이용에 기여할 수 있을 것으로 사료된다.</p> <h1>2. 연구방법</h1> <h2>\( 2.1 \) 연구 대상지 개요</h2> <p>수도권지역의 생활 및 건설폐기물 등의 처리를 위해 조성된 S매립지는 Table \( 2 \)의 두 개의 매립장에 대하여 \( 1992 \)년부터 \( 2018 \)년까지 매립이 이루어졌으며, 현재 세 번째 매립장에 매립이 진행 중이다. 사후관리 중인 두 매립장에서 발생된 매립가스는 수평가스 포집관 \( 48 \)개, 이격구간 가스 포집관 \( 60 \)개 및 수직가스 포집관 \( 329 \)개에 의해 포집되고 있고, 포집된 매립가스는 \( 6 \)대의 가스 블로워, \( 31 \)개의 가스 분배실 등에 의해 총 \( 80.5 \mathrm { km } \) 의 가스이송관로를 거쳐서 최종적으로 Fig. \( 1 \)의 \( 50 \mathrm { MW } \) 규모의 매립가스 발전시설로 공급되고 있다.</p>	[ "THIOPAQ 공정은 매립가스내 \\( \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { S } \\) 의 효과적 제거, 고품질 바이오황 생산을 위해 유입 매립가스내 황 부하의 변동에 따른 미생물학적 내부 메커니즘의 유지관리가 중요하다. 수도권지역의 매립가스를 대상으로 THIOPAQ 시설을 설치한 후 최적의 공정지표별 운전조건을 연구하여 매립가스내 \\( \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { S } \\)의 효과적 제거 및 고품질 바이오황 생산을 높일 수 있는 것으로 보인다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1456-4a7a-bf57-ca8c1e2971d6_03	생명LA	미생물 공법에 의한 매립가스 황화수소 제거 및 바이오황 생산	<p>\( \mathrm { CO } _ { 2 } + \mathrm { OH } ^ { - } \rightarrow \mathrm { HCO } _ { 3 } ^ { - } \)<caption>(3)</caption></p> <p>\( \mathrm { HCO } _ { 3 } ^ { - } + \mathrm { OH } ^ { - } \rightarrow \mathrm { CO } _ { 3 } ^ { 2- } + \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)<caption>(4)</caption></p> <p>흡수탑에서 생성된 용액 \( \left ( \mathrm { NaHS } + \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \right ) \)은 이후 미생물 반응조로 이송된다. 미생물반응조는 대기압과 유사한 압력에서 운전되며, 반응기 공기 공급량은 황산염 발생량을 최소화할 수 있도록 자동제어시스템으로 조절하였다. 미생물 반응조에서 \( \mathrm { NaHS } \) 성분은 간상균류(Thiobacillus)의 작용에 의하여 식 \( (5) \) 와 같이 황으로 전환된다. 미생물 반응조에서는 흡수탑에서 손실된 \( \mathrm { OH } ^ { - } \)가 식 ( \( 5 \))에 의하여 일부 재생되지만, 식 ( \( 6 \))의 반응도 일어나기 때문에 \( 25 \% \) \( \mathrm { NaOH } \) 수용액을 계측장치가 부착된 펌프를 이용하여 지속적 재공급하였다. 운전기간 동안 자동계측장치를 통해 미생물반응조 내의 수용액의 양과 유출양이 일정수준이 되도록 조절함으로써 황산염이온의 축적을 방지하도록 하였고, 생성된 기체는 대기로 배출시켰다. 한편, 미생물에 필요한 영양소는 \( 12 \)종류의 염류로 구성되는 Nutrimix \( 34 / 32 \) solution을 사용하였다.</p> <p>\( \mathrm { NaHS } + 1 / 2 \mathrm { O } _ { 2 } \rightarrow \mathrm { S } ^ { 0 } + \mathrm { NaOH } \)<caption>(5)</caption></p> <p>\( 2 \mathrm { NaHS } + 4 \mathrm { O } _ { 2 } \rightarrow \mathrm { NaHSO } _ { 4 } \leftrightarrow \mathrm { Na } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } + \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \)<caption>(6)</caption></p> <p>미생물반응조에서 유출된 현탁액은 침전조에서 물과 분리한 뒤 침전물의 일부는 공정유지에 필요한 만큼 재활용하고 나머지는 탈수 후 회수하였다. 또한 상등수의 일부를 흡수탑으로 재순환하여 사용하고 잉여분은 폐수로 배출하였다. Fig. \(2 \)는 본 연구에서 사용한 THIOPAQ 공법의 황화수소 제거설비의 공정 구성도이고, Table \(3 \)은 동 설비의 세부사양이다.</p>	[ "흡수탑에서 생성된 \\( \\mathrm { NaHS } + \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { O } \\) 용액은 미생물 반응조로 이송되며, 여기서 간상균류에 의해 \\( \\mathrm { NaHS } \\) 성분이 황으로 전환된다. 이 과정에서 흡수탑에서 손실된 \\( \\mathrm { OH } ^ { - } \\)이 일부 재생되지만, 추가적인 \\( 25 \\% \\) \\( \\mathrm { NaOH } \\) 수용액을 계측장치가 부착된 펌프로 계속 공급해야 한다. 또한 미생물에 필요한 영양소는 Nutrimix \\( 34 / 32 \\) solution을 사용하였다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1456-4a7a-bf57-ca8c1e2971d6_02	생명LA	미생물 공법에 의한 매립가스 황화수소 제거 및 바이오황 생산	<p>S매립지는 생활 및 건설폐기물이 함께 처리됨에 따라 일반적인 생활폐기물 매립장과는 달리 고농도의 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \)가 발생하고 있다. 다만, Table 2에서 보는 바와 같이 2000년 10월 매립이 종료된 제 1매립장은 2018년 9월 종료된 제2매립장에 비하여 매립가스발생량과 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \) 농도가 크게 감소한 상태이다.</p> <h2>2.2 공법 및 전처리 설비</h2> <p>발전소로 공급되는 매립가스내 고농도 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \)의 제거를 위해 THIOPAQ 공법에 의한 두 개의 매립가스 전처리시설을 병렬로 설치하였다. 각 시설은 크게 세 개의 단위공정으로 이루어겨 있는데, 매립가스에 포함된 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \)를 흡수시키는 흡수탑(Scrubber), 미생물에 의하여 황화물을 원소 황으로 전환하는 미생물반응조(Bioreactor) 그리고 침전조와 탈수기로 구성된 황 분리 회수계통이다. 매립가스가 흡수밥에 유입되면 매립가스내 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } \)는 노즐을 통해 상부에서 뿌려지는 \( \mathrm { pH~ } 8 \sim 9 \)의 가성소다 \( ( \mathrm { NaOH } ) \) 순환수와 식 (1)과 같이 반응한다. 이때 생성된 황화물( \( \mathrm { NaHS } \))의 일부는 식 (2)에 의해 황산으로 변화된다. 알칼리도의 소모는 대부분 식 (1)에 의하나, 소량이 식 (3)에 따라 소모되어 식 (4)와 같이 탄산염을 생성한다.</p> <p>\( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { S } + \mathrm { NaOH } \rightarrow \mathrm { NaHS } + \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)<caption>(1)</caption></p> <p>\( 2 \mathrm { NaHS } + 4 \mathrm { O } _ { 2 } \rightarrow 2 \mathrm { NaHSO } _ { 4 } + \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \)<caption>(2)</caption></p>	[ "S매립지의 고농도 \\( \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { S } \\) 발생을 줄이기 위해 THIOPAQ 공법에 의한 두 개의 매립가스 전처리시설이 병렬로 설치되었다. 흡수탑, 미생물반응조, 침전조, 탈수기로 구성된 공정은 매립가스내 \\( \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { S } \\)를 흡수하고 황화물을 원소 황으로 전환하며 황 분리 회수계통을 통해 고농도 \\( \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { S } \\)를 제거한다." ]
55e-0c9-13bf9bc0-82b1-4fcc-97b5-132795c375f9_01	생명LA	화장품 소재로써의 딱지꽃(Potentilla chinensis ) 뿌리 추출물의 효과	<p>세포배양. 각각의 피부 세포주를 dulbecco's modified eagle medium (DMEM), \(10 \% \) FBS, \( 1 \% \) penicillin-streptomycin (GIBCO, Grand Island, NY, USA)의 배지에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(5 \% \) \( \mathrm { CO } _ { 2 } \)의 조건으로 배양하였다. 독성 실험, 염증 실험 그리고 보습효과 실험에는 HaCaT 세포를 사용하였고 주름개선 효과에는 CCD \(986 \)sk 세포주가 사용되었다. 그리고 미백 효과실험에는 B \( 16 \)F \( 10 \) 세포주가 사용되었다. 위에 사용된 모든 세포는 한국세포주은행에서 분양 받아서 사용하였다.</p> <p>Real time PCR 분석. 세포를 \(96 \) well plate에서 배양하고 FBS를 포함하지 않는 DMEM 배지로 교환하고 시료를 처리하여 \(24 \)시간 동안 추가 배양하였다. 배양 후 SuperPrep \( ^ {\mathrm { TM } } \) Cell Lysis & RT Kit를 이용하여 RNA를 추출하고 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA를 template로 하여 Thunderbird \( ^ {\mathrm { TM } } \) SYBR qPCR Mix (Toyobo, TOQPS- \(201 \))를 사용하여 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR machine으로 real time PCR을 수행하였다. Primer는 QuantiTect \( ^ { Ⓡ } \) Primer Assays (Cat no. QT \(00040586 \), QT \(01005725 \), QT \(00014581 \), QT \(00212996 \), QT \(01192646 \)) (QIAGEN, Valencia, California, USA)를 사용하였다.</p> <p>Melanin 정량 실험. B \(16 \)F \(10 \) cell을 \(6 \) well에 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well이 되도록 분주하여 \(24 \)시간 뒤, 각각의 well에 딱지꽃 추출물을 농도별로 ( \( 1 \), \(2.5 \), \(5 \% \)) 처리하고 positive control로 kojic acid \( (16 \mu \mathrm { M } ) \)를 \(48 \)시간 동안 처리하였다. 처리 후 phosphate buffered saline로 \(2 \)회 세척한 후 \( 12,000 \mathrm { rpm } \), \(4 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \(30 \)분간 원심 분리하여 세포 침전물을 만들었다. \( 10 \% \) DMSO가 첨가된 \( 1 \mathrm { ~N } \) \( \mathrm { NaOH } \) 용액을 \( 150 \mu \mathrm { L } \) 첨가하고 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 \(1 \)시간 용해하였으며 \( 405 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정한 후 실험군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하여 나타내었다.</p>	[ "HaCaT, CCD 986sk, B 16F10 세포는 DMEM, 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin 배지에서 37\\(^\\circ \\mathrm{C}\\), 5% CO2 조건에서 배양하여 독성, 염증, 보습, 주름개선, 미백 효과 실험에 사용되었고, Real Time PCR 분석을 위해 96 well plate에서 배양하고 FBS를 포함하지 않는 DMEM 배지로 교환하여 RNA 추출 및 cDNA 변환 후 Real Time PCR 분석을 수행하였다." ]
55e-0c9-13bf9bc0-82b1-4fcc-97b5-132795c375f9_00	생명LA	화장품 소재로써의 딱지꽃(Potentilla chinensis ) 뿌리 추출물의 효과	<h1>재료 및 방법</h1> <p>실험재료. 딱지꽃은 장미과 식물로써 본 실험에 사용된 딱지꽃은 정선 배서영농조합과 진주 영농조합법인 이노플랜트 두 곳에서 수급하여 사용하였다. 수급 된 딱지꽃은 건조시킨 후 메탄올 추출하였으며 추출된 추출물은 냉장보관 하였다.</p> <p>시약 및 기기. 딱지꽃 뿌리 추출물의 독성 평가를 위한 \(3 \)-[ \(4 \), \(5 \)dimethylthiazol- \(2 \)-yl]- \(2 \), \(5 \)-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 및 dimethylsulfoxide (DMSO)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 또한 MTT assay 수행 시 UV Spectrophotometer (Thermo, Waltham, MA, USA)를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광을 확인하였다. 그리고 딱지꽃 뿌리 추출물을 피부세포에 처리 후 특정 단백질의 양을 확인 하기 위해 real time PCR kit을 수행하였다. 이를 수행할 시 Rotor Gene Q Realtime PCR machine (QIAGEN, Valencia, CA, USA)를 주로 사용하였으며, SuperPrep \( ^ {\mathrm { T M } } \) Cell Lysis & RT Kit for qPCR (Toyobo, Kita-ku, Osaka, Japan, TOSCQ- \(101 \))를 이용하여 세포의 RNA를 추출하였다. 실험에 사용한 피부세포로는 HaCaT (Keratinocyte), CCD \(986 \)sk (Fibroblast), B \(16 \)F \(10 \) (melanoma cell)를 한국세포주은행에서 분양하여 사용하였다.</p> <p>딱지꽃 뿌리 추출 방법. 추출을 위하여 딱지꽃 뿌리를 \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(2 \)일 동안 건조하였고, 메탄올( \( 2 \mathrm { ~L } \))을 사용하여 추출하였다. 추출 시 농도는 \( 2 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \)로 추출한 후, 여과하여 그 액을 실험에 사용하였다.</p> <p>세포독성 실험. 딱지꽃 뿌리 추출물의 독성을 평가 하기 위해 MTT assay를 수행하였다. HaCaT cell을 \(24 \) well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \)개의 세포를 분주하여 배양하였다. \(24 \)시간 후 Fetal bovine serum FBS를 포함하지 않는 배지로 교체하고 \(24 \)시간 동안 starvation하고, 시료를 농도별로 처리하였다. 그 후 \(24 \)시간 동안 배양하고 배지를 제거한 뒤 \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 농도의 MTT 시약을 각 \( 40 \mu \mathrm { L } \)씩 처리 후 \(4 \)시간 동안 추가 배양하였다. \(4 \)시간 뒤 배지를 제거하고, DMSO를 \( 1 \mathrm { ~mL } \)씩 넣고 \(10 \)분간 흔들어 준 다음 \( 200 \mu \mathrm { L } \)씩 \(96 \) well에 취하여 UV Spectrophotometer로 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>	[ "장미과 식물인 딱지꽃은 정선과 진주 이노플랜트에서 수급하였고 수급 된 딱지꽃은 건조시킨 후 메탄올 추출하였으며 추출된 추출물은 냉장 보관하였다. 딱지꽃 뿌리 추출물의 독성을 평가 하기 위해 MTT assay를 수행하였고 추출을 위해 딱지꽃 뿌리를 \\( 60 ^ {\\circ } \\mathrm { C } \\) 에서 \\(2 \\)일 동안 건조하였고, 메탄올( \\( 2 \\mathrm { ~L } \\))을 사용하였다." ]
55e-0c9-78343993-2473-4046-bb77-ac58993337fc_01	생명LA	산복사나무(Prunus davidiana ) 열매로부터 Triterpenoid의 분리 및 동정	<h3>\( \mathrm { EtOAc } \) 분획으로부터 triterpenoid의 분리</h3> <p>\( \mathrm { EtOAc } \) 분획 \( (135 \mathrm { ~g } ) \)으로부터 \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \) c.c. \( [14.5 \times 16 \mathrm { ~cm } \), \(n \)-hexane- \( \mathrm { EtOAc } = 7: 1 \rightarrow \) chloroform \( \left ( \mathrm { CHCl } _ { 3 } \right )- \mathrm { MeOH } =30: \mathrm { l } \rightarrow \mathrm { CHCl } _ { 3 } - \mathrm { MeOH } \)-water \( =30: 3: 1 \rightarrow 25: 3: 1 \rightarrow 20: 3: 1 \rightarrow 15: 3: 1 \rightarrow 10: 3: 1 \rightarrow 5: 3: 1 \), 각 \( 25 \mathrm { ~L } \) ]를 실시하여 \( 19 \) 개의 분획(PDFE- \(1 \)-PDFE- \( 19 \))을 얻었다. PDFE- \( 3 \) \( [2.99 \mathrm { ~g } \), elution volume/total volume \( ( \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } )=0.038-0.062 \) ]을 \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \) c.c. \( (2.5 \times 15 \mathrm { ~cm } \) , \(n \)-hexane- \( \mathrm { EtOAc } \) \( =15: 1,35 \mathrm { ~L } ) \) 를 실시하여 \( 18 \)개의 분획(PDFE- \( 3 \)- \( 1 \)-PDFE- \( 3 \)- \( 18 \))으로 나누었고, 그 중 화합물 \( 3 \) [PDFE- \( 3 \)- \( 4 \), \( 172.6 \mathrm { mg } , \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } =0.167-0.192 \) , TLC \( \left ( \mathrm { SiO } _ { 2 } \mathrm { ~F } _ { 254 } \right ) \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } 0.46, n \)-hexane- \( \mathrm { EtOAc } \) \( =4: 1 \), TLC \( \left ( \mathrm { ODS } \quad \mathrm { F } _ { 254 \mathrm { ~S } } \right ) \) \( \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } 0.46 \), acetone-water \( \left .=20: 1 \right ] \) 을 분리하였다. PDFE- \( 9 \) ( \( 14.3 \) g, \( \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } =0.218-0.263) \) 을 \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \) c.c. \( \left (7.0 \times 13.5 \mathrm { ~cm } , n \right . \)-hexane- \( \mathrm { CHCl } _ { 3 ^ { - } } \) \( \mathrm { MeOH } =15: 3: 1,11 \mathrm { ~L } ) \) 를 실시하여 \(12 \)개의 분획(PDFE- \( 9 \)- \( 1 \)-PDFE- \( 9 \)- \( 12 \))으로 나누었다. PDFE- \( 9 \)- \( 9 \) ( \( 6.85 \) g, Ve/ \( \mathrm { Vt } =0.350 \) \( 0.798) \) 을 ODS c.c. \( (5.0 \times 9.5 \mathrm { ~cm } \), \( \mathrm { MeOH } \)-water \(=4: 1,24 \mathrm { ~L } ) \) 를 실시하여 \(17 \)개의 분획(PDFE- \( 9 \)- \( 9 \)- \( 1 \)-PDFE- \( 9 \)- \( 9 \)- \( 17 \))으로 나누었고,그 중 화합물 \( 1 \) [PDFE- \( 9 \)- \( 9 \)- \( 15 \), \( 154.2 \mathrm { mg } , \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } =0.577-0.677 \),TLC \( \left ( \mathrm { SiO } _ { 2 } \mathrm { ~F } _ { 254 } \right ) \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } 0.49, \mathrm { CHCl } _ { 3 } - \mathrm { MeOH } \)-water \( =13: 3: 1 \), TLC (ODS \( \mathrm { F } _ { 254 \mathrm { ~S } } \) ) \( \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } 0.24 \), MeOH-water \( \left .=10: 1 \right ] \) 을 분리하였다. PDFE- \( 9 \)- \( 9 \)- \( 11 \) ( \( 353.6 \) mg, \( \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } =0.099-0.158) \) 을 \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \) c.c. \( (3.5 \times 12 \mathrm { ~cm } \), \( \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)- \( \mathrm { MeOH } \)-water \(=33: 3: 1,2.7 \mathrm { ~L } \) 를 실시하여 \(11 \) 개의 분획(PDFE- \( 9 \)- \( 9 \)- \( 11 \)- \( 1 \)-PDFE- \( 9 \)- \(9 \)- \( 11 \)- \( 11 \))으로 나누었고, 그 중 화합물 \( 2 \) [PDFE- \( 9 \)- \( 9 \)- \( 11 \)- \( 5 \), \( 32.8 \mathrm { mg } , \mathrm { Ve } / \mathrm { Vt } =0.096-0.104 \), TLC \( \left ( \mathrm { SiO } _ { 2 } \mathrm { ~F } _ { 254 } \right ) \) \( \mathrm { R } _ {\mathrm { f } } 0.25, \mathrm { CHCl } _ { 3 } - \mathrm { MeOH } - \) water \( =20: 3: 1, \quad \) TLC \( \left ( \right . \) ODS \( \mathrm { F } _ { 254 \mathrm { ~S } } \) ) \( \mathrm { R } _ {\mathbf { f } } \) \( 0.38, \mathrm { MeOH } - \) water \( =12: 1] \)을 분리하였다.</p>	[ "PDFE-\\(9\\)-\\(9\\)(\\(6.85\\)g, Ve/\\(\\mathrm{Vt}=0.350\\)\\(0.798)\\)을 ODS c.c.\\((5.0\\times 9.5\\mathrm{ cm}\\), \\(\\mathrm{MeOH}\\)-water \\(=4:1,24\\mathrm{L})\\)를 실시하여 \\(17\\)개의 분획(PDFE-\\(9\\)-\\(9 \\)-\\(1\\)-PDFE-\\(9\\)-\\(9\\)-\\(17\\))으로 나누었고,그 중 화합물 \\(1\\)[PDFE-\\(9\\)-\\(9\\)-\\(15\\), \\(154.2 \\mathrm{mg},\\mathrm{Ve}/\\mathrm{Vt}=0.577-0.677\\),TLC\\(\\left(\\mathrm{SiO}_{2}\\mathrm{F }_{254}\\right)\\mathrm{R}_{\\mathrm{f}}0.49, \\mathrm{CHCl}_{3}-\\mathrm{MeOH}\\)-water\\( =13:3:1\\), TLC(ODS\\(\\mathrm{F}_{254\\mathrm{S}}\\))\\(\\mathrm{R}_{\\mathrm{f}}0.24\\), MeOH-water\\(\\left .=10:1\\right]\\)을 분리하였다." ]
55e-0c9-78343993-2473-4046-bb77-ac58993337fc_00	생명LA	산복사나무(Prunus davidiana ) 열매로부터 Triterpenoid의 분리 및 동정	<h2>재료 및 방법</h2> <h3>실험재료</h3> <p>본 실험에 사용한 산복사나무(Prunus davidiana) 열매는 \(2013 \)년 \(6 \)월 장수 약초(Anyang, Korea)에서 구입하였고, 우석대학교 약학대학 김대근 교수가 동정하였다. 표본시료(KFMMEL- \( 201306 \))는 경희대학교 능성 소재 및 대사공학 실험실에 보관되어 있다.</p> <h3>시약 및 기기</h3> <p>Open column chromatography (c.c.)용 \( \mathrm { SiO } _ { 2 } \)은 Kiesel gel \( 60 \) (Merck, Darmstadt, Germany)을 ODS gel은 LiChroprep RP- \( 18 \) (Merck)을 사용하였다. TLC는 Kiesel gel \( 60 \mathrm { ~F } _ { 254 } \) 와 RP- \(18 \) \( \mathrm { F } _ { 254 \mathrm { S } } \) (Merck)를 사용하였고, \( \mathrm { TLC } \) 상의 물질 검출은 UV lamp (Spectroline, Model ENF- \( 240 \) C/F, Spectronics Corporation, Westbury, NY, USA)로 확인 후, \( 10 \% \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } \)를 분무한 후 가열하여 발색양상을 조사하였다. NMR spectrum은 Varian Inova AS \( 400 \) (Varian, Palo Alto, CA, USA)으로 측정하였고, IR spectrum은 Perkin model \( 599 \) B (Waltham, MA, USA)로 측정하였다. 비선광도는 polarimeter P- \( 1020 \) (JASCO, Tokyo, Japan)로 측정하였으며, Electronic ionization mass spectrometry (EI/MS)는 JEOL JMS 505-WA (Tokyo, Japan)으로 측정하였다. 융점은 Fisher-Johns 융점 측정기(Fisher Scientific, Miami, FL, USA) 를 사용하여 측정하였고, 미보정하였다.</p> <h3>추출 및 분획</h3> <p>산복사나무 열매 생체 \( 40 \mathrm { ~kg } \) 에 대하여 \( 100 \% \mathrm { MeOH } \) 용액(45 \( \mathrm { L } ) \), \(80 \% \mathrm { MeOH } \) 수용액 \( (45 \mathrm { ~L } \times 3) \) 을 가하여 실온에서 \(24 \) 시간 \(3 \)회 추출한 후 여과지로 여과하였다. 얻어진 추출물을 감압 농축하여 \( \mathrm { MeOH } \) 추출물 \( (2.7 \mathrm { kg } ) \) 을 얻었다. 얻어진 추출물은 물( \( 3 \)L)와 \( \mathrm { EtOAc } \) \((4 \mathrm { L } \times 3) \) 로 분배 추출하였고, 물 \( (3 \mathrm { L } ) \) 분획은 다시 \( n \)- \( \mathrm { BuOH } \) \( (3 \mathrm { L } \times 3) \) 로 분배 추출하였다. 각 층을 감압 농축하여 \( \mathrm { EtOAc } \) 분획(PDFE, \( 135.6 \mathrm { g } ) \), \( n \)- \( \mathrm { BuOH } \) 분획(PDFB, \( 208.8 \mathrm { g } \) ) 및 물 분획(PDFH, \( 2.36 \mathrm { kg } ) \) 을 얻었다.</p>	[ "산복사나무 열매 생체 \\( 40 \\mathrm { ~kg } \\) 에 대하여 \\( 100 \\% \\mathrm { MeOH } \\) 용액(45 \\( \\mathrm { L } ) \\), \\(80 \\% \\mathrm { MeOH } \\) 수용액 \\( (45 \\mathrm { ~L } \\times 3) \\) 을 가하여 실온에서 \\(24 \\) 시간 \\(3 \\)회 추출한 후 여과지로 여과하고 물 \\( (3 \\mathrm { L } ) \\) 분획은 다시 \\( n \\)- \\( \\mathrm { BuOH } \\) \\( (3 \\mathrm { L } \\times 3) \\) 로 분배 추출하였다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1a79-43db-bf7e-c1cdf862b954_04	생명LA	타가토스와 에리스리톨로 제조한 다쿠아즈의 물리화학적 특성 연구	<h2>비중</h2> <p>비중 결과는 Fig. 1B에 나타내었다. (반죽의 무게/물의 무게)으로 측정하였고, 다쿠아즈 각각의 비중을 측정 결과 \( \mathrm { TE } >\mathrm { TS } >\) \( \mathrm { T } >\mathrm { S } \) 순으로 나타났다. TE가 다른 군에 비해 수치가 제일 높게 나왔으나 군들 간의 유의적인 차이는 없었다. 반죽의 비중은 케익이나 베이커리 제품의 부피와 관련이 있는데 (Lakshminarayan 등, 2006), 비중이 높으면 다쿠아즈의 부피가 줄어들게 된다. 비중 값이 다르게 나타나는 것은 만들어진 제품의 품질이 다르게 변하는 것을 의미하지만, 실험결과 비중에서 큰 차이를 보이지 않았다. 결과적으로 \( 0.01 \) 정도의 미미한 차이로 대체감미료는 비중에 큰 영향을 끼치지 않았다.</p> <h2>퍼짐성</h2> <p>퍼짐성은 굽기 전과 구운 후의 다쿠아즈의 직경 \( ( \mathrm { cm } ) \)을 두께 \( ( \mathrm { cm } ) \)로 나누어 측정하여 나타낸 것으로 Fig. 2A에 나타내었다. 퍼짐성 측정 결과 \( \mathrm { TE } >\mathrm { TS } >\mathrm { T } >\mathrm { S } \) 순으로 나타났으나 유의적인 차이는 없었다.</p> <p>Pasha 등(2002)은 대체감미료를 사용한 쿠키의 품질에 대하여 연구하였는데, 설탕과 fructose를 \( 1: 1 \) 로 넣은 쿠키의 spread factor가 \( 40.8 \), 설탕이 \( 36.8 \), fructose가 \( 34.6 \mathrm { ~cm } \) 를 나타내었고, polyols 류(sorbitol, mannitol)의 spread factor 값은 \( 32.1 \) 이하로 낮게 나타났다고 보고하였다. Pareyt 등(2009)은 설탕의 첨가량을 달리 제조하였을 때, 쿠키 반죽의 점도와 쿠키의 구조에 영향을 미쳤는데 특히 쿠키의 높이와 쿠키에 생기는 균열에 영향을 미친다고 보고하였다. Akesowan (2009)은 대체감미료의 량이 증가할수록 케익의 부피가 감소하고, 무게와 수분활성도는 증가하였다고 보고하였다. Ronda 등(2005)은 polyols계의 대체 감미료를 첨가한 케익이 설탕으로 제조한 것에 비하여 낮은 부피를 나타냈다고 보고하였다. 본 실험에서는 대체감미료에 따라 퍼짐성이 달라지는 모습을 보이기는 하였으나 유의적인 차이는 없었고, Pasha 등(2002)과 Ronda 등(2005)의 결과와 달리 TE 의 퍼짐성 지수가 가장 높았으나, 유의적인 차이를 보이지는 않 앗다.</p> <h2>손실률(loss factor)</h2> <p>손실률은 구운 후의 다쿠아즈를 굽기 전의 반죽으로 나눈 후 백분율로 나타내었으며, 결과는 Fig. \( 2 \mathrm { ~B } \) 에 나타내었다. 손실률의 수치는 \( \mathrm { S } >\mathrm { T } >\mathrm { TS } >\mathrm { TE } \) 순으로 설탕으로 제조한 다쿠아즈의 손실률이 가장 컸다. \( \mathrm { S } \) 와 T간에 유의적인 차이는 없었으나 \( \mathrm { S } \) 보다 \( \mathrm { T } \) 의 손실률이 더 낮았고 \( \mathrm { TE } , \mathrm { TS } \) 순으로 낮은 손실률을 보였다. 설탕을 타가토스로 대체한 \( \mathrm { T } \) 가 \( \mathrm { S } \) 보다 손실률이 낮았고, 분당을 타가토스로 대체한 \( \mathrm { TS } \) 군과 에리스리톨과 타가토스를 함께 첨가한 \( \mathrm { TE } \) 군이 T보다 낮은 손실률을 보였다. Hwang (2014) 등은 타가토스의 첨가량에 따른 머핀의 품질에 대해 연구하였는데 타가토스의 첨가량이 증가할수록 손실률이 감소하였다고 보고하였다. 본 실험결과 Hwang (2014) 등의 결과와 유사하게 타가토스의 첨가량이 증가할수록 다쿠아즈의 손실률이 적은 경향을 보였다. 결과적으로 분당을 타가토스나 에리스리톨로 대체하여 다쿠아즈를 제조하였을 때 손실률이 더 낮았다.</p>	[ "비중과 퍼짐성의 측정 결과 TE >TS >T >S 순으로 나타났으나, 군들 간의 유의적인 차이는 없었다. 대체감미료에 따라서 퍼짐성이 달라지는 모습을 보였으나 유의적인 차이는 없었고, TE 의 퍼짐성 지수가 가장 높았으며, 유의적인 차이는 보이지 않았다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1a79-43db-bf7e-c1cdf862b954_05	생명LA	타가토스와 에리스리톨로 제조한 다쿠아즈의 물리화학적 특성 연구	<h2>색도(chromaticity)</h2> <p>다쿠아즈의 색도를 Table 2에 나타내었다. 쿠키의 색도는 명도 (L; lightness), 적색도(a; redness), 황색도(b; yellowness)를 3회 반복 측정하였고 평균값을 구하여 나타내었다. 명도 값은 \( \mathrm { S } >\) \( \mathrm { T } >\mathrm { TS } >\mathrm { TE } \) 순서였고, 적색도는 \( \mathrm { TS } >\mathrm { T } >\mathrm { TE } >\mathrm { S } \) 순서였으며, 황색도는 \( \mathrm { S } >\mathrm { T } >\mathrm { TS } >\mathrm { TE } \) 의 순서로 결과가 나왔다. \( \mathrm { S } \)는 명도와 황색도에서 가장 높은 값을 나타내었고, 적색도에서는 가장 낮은 값을 나타내었다. 타가토스 첨가량이 증가할수록 적색도는 높아지는 경향을 보였고, 설탕첨가량이 증가할수록 명도와 황색도가 증가하는 경향을 보였다.</p> <p>Taylor 등(2008)은 타가토스로 제조한 쿠키가 설탕으로 제조한 쿠키에 비하여 타가토스 량이 증가할수록 적색도는 높아지고, 명도는 유의적으로 낮은 값을 나타내었고 보고하였다. Hwang 등(2015)도 타가토스의 첨가량이 증가할수록 명도값은 감소하고, 적색도는 증가하였다고 보고하였다. 이러한 갈변현상은 감미료인 설탕, 타가토스, 에리스리톨이 오븐으로 열처리되면서 Maillard반응과 caramelization으로 인해 발생된다. Maillard 반응은 당이 가지는 환원당이 아미노산을 만나면서 갈변되고 풍미를 내는 반응이다(Maillard 1912). 2분자 화합물인 설탕은 1 개의 환원당을 가지고 있어 적당한 갈변이 일어나나, 1분자 화합물인 타가토스는 1개의 환원당을 가지고 있고, 설탕에 비하여 \( \mathrm { g } \)당 unit의 수가 많으므로 갈변이 더 많이 일어난다. 알코올 유래당인 에리스리톨의 경우 환원당을 가지고 있지 않아 갈변이 적게 일어난 것으로 보인다(Kim 1994). 결과적으로 타가토스의 함량이 많아질수록 명도는 감소하고 적색도는 증가하였으며, 에리스리톨 첨가 시 명도와 황색도가 낮아졌다.</p> <h2>조직감(texture)</h2> <p>다쿠아즈의 조직감은 Table 3에 나타내었다. 경도실험결과 \( \mathrm { S } >\mathrm { TS } \) \( >\mathrm { T } >\mathrm { TE } \) 순으로 높게 나타났고, 부서짐성의 경우 \( \mathrm { TE } >\mathrm { S } >\mathrm { T } \) \( >\mathrm { TS } \) 순으로 높게 나타났으며, 점착성의 경우 \( \mathrm { TE } >\mathrm { TS } >\mathrm { T } >\mathrm { S } \) 순으로 높은 값을 나타내었다. 탄력성과 응집성의 경우 \( \mathrm { TS } >\mathrm { TE } \) \( >\mathrm { S } >\mathrm { T } \) 순으로 높게 나타났는데, 에리스리톨을 첨가한 TE가 TS 보다 낮은 것으로 보아, 타가토스가 에리스리톨, 설탕에 비하여 다쿠아즈의 탄성과 응집성을 높이는 역할을 한 것으로 사료된다.</p>	[ "Taylor 등은 타가토스로 제조한 쿠키의 갈변현상을 관찰하였는데, 설탕 대비 타가토스의 갈변이 심한 것으로 나타났다. 이는 설탕과 타가토스가 열처리 과정에서 Maillard반응과 caramelization으로 인해 갈변이 일어나기 때문이다. 단, 에리스리톨은 환원당을 가지고 있지 않아 갈변현상이 적었다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1a79-43db-bf7e-c1cdf862b954_06	생명LA	타가토스와 에리스리톨로 제조한 다쿠아즈의 물리화학적 특성 연구	<p>\( \mathrm { TE } \) 는 \( \mathrm { S } \) 와 비교 하였을 때, 경도 값이 낮고 부서짐성과 점착성, 탄력성, 응집성이 높은 것으로 보아, 에리스리톨로 다쿠아즈를 제조할 경우 부드럽지만 잘 부서지고, 점착성과 탄력성이 좋을 것으로 보인다. TS는 경도에서 S보다는 낮지만 TE 보다는 높은 값을 보였고, 부서짐성은 S와 TE보다 낮았고 \( \mathrm { T } \) 와 유사한 값을 나타내었다. TS로 다쿠아즈를 제조할 경우 부드럽고 잘 부서지지 않으며 탄력성과 응집성이 좋을 것으로 사료된다. Taylor(2006)는 타가토스 \( 25 \% \)로 제조한 쿠키의 경도가 설탕에 비하여 낮은 값을 나타내었고, 점착성과 탄력성, 응집성은 높은 값을 나타내었다고 보고하였는데, 본 실험의 \( \mathrm { S } \) 와 \( \mathrm { TS } \)의 결과가 Taylor(2006)의 결과와 유사한 경향을 보였다. 결과적으로 타가토스가 더 많이 함유되어 있는 TS의 조직감이 가장 좋은 결과를 나타내었다.</p> <h2>열량(Calorie)</h2> <p>열량 표시는 각 다쿠아즈의 배합 비에 존재하는 재료의 \( 100 \mathrm { ~g } \)당 kcal를 대체감미료 별로 나타내었다. Table 4 열량의 경우 \( S \) \( >\mathrm { T } >\mathrm { TS } >\mathrm { TE } \) 순으로 \( \mathrm { S } \) 의 열량이 가장 높았고, \( \mathrm { TE } \) 의 열량이 가장 낮았으며, 설탕의 경우 \( \mathrm { S } >\mathrm { T } >\mathrm { TS } >\mathrm { TE } \) 의 순으로 \( \mathrm { TE } \) 의 량이 가장 낮았다. 단백질과 지방의 경우 합산 결과 모든 군이 같은 결과를 나타내었다.</p> <p>당지수는 일정한 양의 식품의 탄수화물을 섭취한 후 혈당 상승 정도를 표준 탄수화물을 섭취 후의 혈당 상승 정도와 비교한 값으로(Kim 등, 2012), 일반적으로 당지수가 낮은 식품은 소장에서 흡수가 적고 간에서 포도당으로 전환되는 속도가 느려서 상대적으로 적은 인슐린을 분비시킨다(Kim과 Kim 2008). 설탕(68), 타가토스(3), 에리스리톨(1) 순으로 높은 당지수를 나타내므로, 에리스리톨을 함유한 TE의 열량과 당지수가 가장 낮게 나타났고, 타가토스가 함유된 TS에서 낮은 열량과 당지수를 나타내었으며, T는 \( \mathrm { S } \) 와 비교하였을 때, 탄수화물의 함량은 큰 차이는 없었으나(T) 낮은 당지수를 나타내었다. Kang 등(2014)은 설탕과 타가토스, 자일로즈로 제조한 초콜릿을 섭취 후 혈당 변화에서 타가토스군이 설탕군에 비하여 유의적으로 혈당을 낮추었다고 보고하였고, 타가토스를 섭취하였을 때 열량과 당지수가 낮다고 보고하였다. 이는 타가토스가 혈당변화에 영향을 주지 않은 것으로 보이며, 타가토스로 제조한 다쿠아즈는 열량이 낮고 당지수도 낮으며 혈당을 크게 증가하지 않고, 과다섭취 시 설사, 메스꺼움을 유도하는 에리스리톨에 비하여 안전하므로, 당뇨병환자에게 적합한 간식으로 사료된다.</p>	[ "TE는 부서짐성과 점착성, 탄력성, 응집성이 높은 것으로 보여 다쿠아즈 제조에 적합하다. TS는 경도값이 S보다 낮고 TE보다는 높고, 부서짐성은 S와 TE보다 낮았으며 T와 유사한 값을 나타냈다. Taylor(2006)의 실험결과와 유사한 경향을 보였고, 가장 좋은 결과를 나타낸 것은 타가토스가 더 많이 함유된 TS이다. 열량은 S >T >TS >TE 순으로 높고, 단백질과 지방의 경우 합산 결과 모든 군이 같은 결과를 나타냈다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1a79-43db-bf7e-c1cdf862b954_01	생명LA	타가토스와 에리스리톨로 제조한 다쿠아즈의 물리화학적 특성 연구	<p>다쿠아즈는 팽창제나 이스트를 사용하지 않고 머랭을 이용한 팽창력에 의존하는 디저트로, 아몬드나 헤이즐넛, 휘핑크림 등을 층으로 제작하여 만든 디저트 케익도 다쿠아즈의 일종이다 (Child와 Simone 1978). 다쿠아즈를 제조하는 반죽은 케이크를 제조할 때의 반죽과 유사하다. 일반적으로 제과, 제빵에서는 설탕을 주재료로 사용하므로 대사성증후군을 가진 사람들이나 당뇨병 환자들에게는 섭취를 제한할 수 밖에 없다.</p> <p>본 연구의 목적은 설탕을 천연감미료로 대체하여 당에 대한 부담감을 줄임으로써, 대사성 증후군이나 당뇨병을 가진 환자들이 섭취할 수 있는 당지수를 낮춘 다쿠아즈를 제조하는 것이다. 또한, 대체 감미료로 제조한 다쿠아즈의 물리적 특성 및 관능 검사를 통하여 고품질의 당지수가 낮은 다쿠아즈를 개발하고자 하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료</h2> <p>본 다쿠아즈 제조 실험해서 사용된 재료는 타가토스(CJ, Incheon, Korea), 에리스리톨(Mitsubishi Kagaku Foods, Tokyo, Japan), 박력분 밀가루(Kyouwon, Chungnam, Korea), 설탕(Kyouwon, Ulsan, korea), 달걀, 아몬드분말(Jilimyanghang, Gyeonggi, Korea), 분당(sugar powder, Kyouwon, Ulsan, Korea), 전분(Seongjin Food, Chungnam, Korea), 바닐라 향 (Jeonwonfood, Gyeonggi, Korea)으로, 시중에 판매되는 제품을 구매하여 다쿠아즈를 제조하는데 사용하였다.</p> <h2>군 분류 및 제조방법</h2> <p>대체 감미료를 사용하여 제조한 다쿠아즈의 조성은 Table1에 나타내었다. 대조군은 설탕 \( ( \mathrm { S } ) \) 으로 정하였고, 실험군 1은 타가토스(T), 실험군 2는 타가토스 + 전분(TS), 실험군 3은 타가토스 + 에리스리톨 + 전분(TE)으로 정하였다. 다쿠아즈의 배합비는 예비 실험에서 다쿠아즈의 최적 배합비율을 탐색하였고, 탐색한 비율로 다쿠아즈를 제조하여 실험에 사용하였다. 바닐라향은 다쿠아즈의 기호도를 높이기 위해 첨가하였다.</p> <p>계란을 흰자와 노른자로 분리한 후, 거품기를 이용하여 머랭 치기를 하였고, 흰자 거품이 거품기에 붙을 때까지 해주었다. 설탕, 대체감미료(타가토스, 에리스리톨)를 2~3번으로 나누어 거품을 낼 때 섞어주었다. 박력분, 전분, 분당, 바닐라향을 체에 쳐서 볼에 넣어 나무주걱으로 섞어준 후, 실험에 사용할 반죽을 제외하고, 짤 주머니에 넣어 유산지를 놓은 오븐 팬 위에 3 \( \mathrm { cm } \) 동그란 크기로 \( 6 \mathrm { ~g } \) 씩 짜고 팬닝을 한 후, \( 180 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 예열한 오븐에 13~15분 정도 구웠다. 굽는 시간은 예비실험을 통해 갈변이 적게 나타나는 적정 시간을 탐색하여 정하였다.</p> <p>구워진 다쿠아즈는 팬에서 분리하여 식힘 망에서 한 시간 식힌 후 바로 실험에 사용하였다. 다쿠아즈 반죽으로는 당도, 비중을 측정하였고, 구운 후 다쿠아즈로는 색도와 조직감을 측정 하였다. 퍼짐성의 경우 굽기 전의 다쿠아즈 반죽과 구운 후의 다쿠아즈의 직경과 두께의 차이로 나타내었고, 손실률의 경우 굽기 전 다쿠아즈 반죽의 무게와 구운 후의 다쿠아즈의 무게를 측정하여 나타내었다.</p>	[ "다쿠아즈는 팽창제 없이 머랭의 팽창력을 이용해 만드는 디저트로, 아몬드나 헤이즐넛, 휘핑크림 등의 재료를 층으로 제작하여 만든 케익이 있다. 이 연구는 설탕 대신 천연감미료를 사용하여 대사성 증후군이나 당뇨병 환자들이 섭취 가능한, 당지수가 낮은 다쿠아즈를 제조하는 것을 목표로 하였다. 시중 제품을 구매하여 사용하였으며, 대체 감미료로 제조된 다쿠아즈의 물리적 특성과 관능 검사를 통해 당지수가 낮은 고품질 다쿠아즈 개발을 추구하였다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1a79-43db-bf7e-c1cdf862b954_00	생명LA	타가토스와 에리스리톨로 제조한 다쿠아즈의 물리화학적 특성 연구	<h1>서 론</h1> <p>근래에 들어 우리나라는 식품의 산업화로 많은 변화를 겪고 있다. 서구화된 식단, 외식의 증가 등으로 식생활이 변화되면서 비만, 당뇨병과 같은 성인병의 발병률이 점점 증가되고 있으며 (Kim 등, 2015) 그 중 당뇨병은 한국인의 10 대 사망원인 중 한 가지로 꼽히고 있다(Lee와 Song 2016). 아시아인들에서 특히 급증하고 있는 제 2형 당뇨병은 인슐린 저항성이 증가할 때 인슐린 분비 장애로 인해 나타나는 질환으로, 노화나 염증, 체중증가 등으로 인슐린 저항성이 증가로 인해 발병된다(Son 등, 2011). 당뇨병 환자나 대사성 증후군을 가진 사람들은 급격한 혈당 변화로 인해 합병증에 노출되기 쉽다. 설탕을 다량 함유하고 있는 식품은 당지수(glycemic index)가 높은 식품으로 혈당을 높이고, 비만, 이상지혈증을 유도하는 단점을 가지고 있다. 가공식품 제조 시 단맛을 내기 위해 설탕을 주로 사용하고 있으나, 다양한 성인병의 원인으로 설탕이 지목되면서 이를 대체할 수 있는 대체감미료에 대한 요구가 증가하고 있다(Kim과 Lee 2016). 설탕은 \( 4 \mathrm { kcal } / \mathrm { g } \) 의 열량을 내며, 체내 흡수가 빨라 당뇨병, 비만과 같은 성인병에 원인물질로 알려져 있고(Lee와 Woo 2001), 과다 섭취 시 비만이 유도될 수 있으며(Ludwig 등,2001), 주의력 결핍 과잉 행동 증후군(Attention Deficit Hyperactivity Disorder; \( \mathrm { ADHD } \) ) 아동이 정상 아동에 비하여 설탕섭취량이 유의적으로 높다(Chung과 Park 1995)는 보고도 있다.</p> <p>천연감미료 중 하나인 타가토스(tagatose)는 \( 1 \mathrm { ~g } \)당 \( 1.5 \mathrm { ~kcal } \)의 열량을 내며, 설탕의 \( 0.92 \) 배의 감미도를 가진다. 타가토스는 과일, 우유 등에 존재하는 천연감미료라는 장점을 가지며, 체내에서 거의 대사되지 않고, 과량을 섭취해도 설사를 유발하지 않으며(Roh 등, 1999), 혈당 강하 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Donner 등, 1996; Kang과 Lee 2016). 타가토스는 한국식품 의약품안전처(KFDA), 미국식품의약국(FDA, GRAS) (Levin 2002), 유럽식품안전국(EFSA)에 높은 품질의 재료로 지정되어 있다. 타가토스의 당지수는 3으로, 당지수가 68인 설탕이나 24인 과당에 비해 매우 낮고, Chiu 등(2011)은 타가토스를 섭취한 당뇨병 환자의 혈당이 낮아졌다고 보고하였다.</p> <p>당 알코올 유래 천연감미료 중 에리스리톨(erythritol)은 \( 1 \mathrm { ~g } \) 당 \( 0.2 \mathrm { kcal } \)로 열량이 거의 없고, 설탕의 약 \( 0.75 \)배의 감미도를 가진다. 에리스리톨은 당지수가 1로 매우 낮으며, 혈당과 인슐린 수치 증가나 혈중 지질에 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있으나(Noda 등, 1994), \( 50 \mathrm { ~g } \) 이상으로 과다하게 섭취할 경우 삼투압으로 인해 설사를 하거나 메스꺼울 수 있다는 보고도 있어 한번에 일정량 이상을 섭취하지 않도록 조절해야 한다(Storey 등, 2007).</p>	[ "우리나라는 식품 산업화와 서구화된 식단 변화로 비만 및 당뇨병 등 성인병 발병률이 증가하고 있다. 설탕 사용의 고객 건강 영향을 고려하여 대체감미료에 대한 수요가 높아졌다. 이 중 타가토스는 설탕이나 과당에 비해 낮은 당지수를 보이며, 당뇨병 환자의 혈당 감소 효과가 있다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1a79-43db-bf7e-c1cdf862b954_02	생명LA	타가토스와 에리스리톨로 제조한 다쿠아즈의 물리화학적 특성 연구	<h2>당도(Sweetness)</h2> <p>대체 감미료에 따른 다쿠아즈의 단맛을 알아보기 위해 당도를 측정하였다. 당도 측정은 굽기 전, 제조한 반죽을 물을 섞어 10배로 희석한 후, 당도계(ATAGO N-50E, Osaka, Japan)를 사용하여 3회 반복 측정하여 평균값으로 나타내었다.</p> <h2>비중(Specific gravity)</h2> <p>대체 감미료에 따른 다쿠아즈의 비중의 변화를 알아보고자 다쿠아즈를 굽기 전 반죽을 물에 넣어 다쿠아즈의 비중을 측정하였다. 비중 컵에 물을 넣어 물의 무게를 측정하고, 다쿠아즈 반죽을 컵에 채워 반죽의 무게를 측정한 뒤 3회 반복하여 비중값으로 사용하였다(AACC 1983). 비중 측정 계산식은 아래와 같다.</p> <p>비중(%) (Specific gravity) = 반죽의 무게/물의 무게</p> <h2>퍼짐성(Spreadability)</h2> <p>다쿠아즈의 퍼짐성은 제조한 다쿠아즈의 굽기 전과 구운 후의 직경과 두께의 차이로 나타내었다. 굽기 전 다쿠아즈의 직경과 두께를 측정하고, 구운 후 다쿠아즈의 직경과 두께를 계산하는 AACC (1985) method 10-50D 방법을 사용하여 퍼짐성을 나타내었다. 3회 반복 측정하여 평균값으로 나타내었으며 계산식은 아래와 같다.</p> <p>퍼짐성 \( ( \) Spread ratio)=제품 1 개의 평균 직경 \( ( \mathrm { cm } ) \)/평균 두께 \( ( \mathrm { cm } ) \)</p> <h2>손실률(Loss factor)</h2> <p>다쿠아즈의 손실률을 측정하기 위해 굽기 전 다쿠아즈의 반죽 무게와 구운 후의 다쿠아즈의 무게를 측정하여 손실률을 계산하였다. 3회 반복 측정하여 평균값으로 나타내었고, 손실률 계산방법은 아래와 같다.</p> <p>손실률 \( ( \%)= \{ ( \mathrm { A } - \mathrm { B } ) / \mathrm { A } \} \times 100 \)</p> <p> <p>\( \mathrm { A } = \)굽기 전 반죽의 무게 \( ( \mathrm { g } ) \)</p> <p>\( \mathrm { B } = \)구운 후 다쿠아즈의 무게 \( ( \mathrm { g } ) \)</p> <h2>색도(Chromaticity)</h2> <p>다쿠아즈의 색도를 측정하기 위해 구운 후의 다쿠아즈를 색도계(Color spectrophotometer, CM-3500d, Minolta Co Ltd., Osaka, Japan)를 사용하여 L값(명도)은 0(black)에서 100 (white)까지, \( \mathrm { a } \)값(적색도)은 \( -80 \)(green)에서 100(red)까지, \( \mathrm { b } \)값(황색도) 는 \( -70 \)(blue)에서 70(yellow)까지의 범위 값을 나타낸다. 각각의 샘플은 3회 반복 측정하여 평균값으로 나타내었다.</p> <h2>조직감(Texture)</h2> <p>다쿠아즈의 조직감을 측정하기 위해 구운 후의 다쿠아즈를 texture analyzer(TA-XT Express, Texture Technologies Co., Ltd., Godalming, England)를 사용하여 경도(Hardness), 부서짐성(Fracturability), 점착성(Adhesiveness), 탄력성(Springness), 응집성(Cohesiveness)을 3회 반복 측정하여 평균값으로 나타내었다.</p>	[ "다쿠아즈의 단맛에 대한 연구로, 대체 감미료에 따른 당도를 측정하였다. 대체 감미료의 영향을 알아보기 위해 다쿠아즈 반죽의 비중을 측정하였다. AACC (1985) method 10-50D를 이용하여 다쿠아즈의 직경과 두께를 측정하고, 굽기 전과 후의 비교를 통해 퍼짐성을 나타냈다. 또한, 굽기 전후의 다쿠아즈 무게를 측정하여 손실률을 계산하였다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1a79-43db-bf7e-c1cdf862b954_03	생명LA	타가토스와 에리스리톨로 제조한 다쿠아즈의 물리화학적 특성 연구	<h2>관능평가(Sensory evaluation)</h2> <p>구운 다쿠아즈를 호서대학교 학생들에게 공지하고 자발적으로 참여한 15명을 대상으로 관능평가 방법을 교육한 후 관능평가를 실시하였다. 5점 척도로 15 명의 평균값을 나타내었으며, 색(color), 향(flavor), 맛(taste), 질감(texture), 전체적 기호도(overall acceptance)의 5가지 항목으로 구성된 관능평가표를 이용하여 실시하였으며, 각 항목에 대해 1점에서 5점까지의 점수를 기입하는 방식으로 설문조사를 하였다(5점: 매우 좋다, 4점: 좋다, 3점: 보통이다, 2점: 싫다, 1점: 매우 싫다).</p> <h2>통계처리(Statistics process)</h2> <p>실험결과는 통계처리 하여 평균 \( \pm \) 표준편차로 측정하였고, SPSS program (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 대체감미료를 달리한 다쿠아즈의 다양한 특성에 대한 통계적 유의성을 one-way ANOVA로 측정하였다. 군들 사이에 통계적 유의성이 있는 것은 Tukey test로 검정하였고, 통계적으로 유의한 경우 \( p<0.05 \)로 나타내었다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>당도</h2> <p>당도 측정결과는 Fig. \( 1 \mathrm { ~A } \) 에 나타내었다. 대조군(설탕, \( \mathrm { S } \) ), 실험군 1(타가토스, T), 실험군 2(타가토스 + 전분, TS), 실험군 3(타가토스 + 에리스리톨 \( + ( \) 타가토스 + 에리스리톨 \( + \) 전분, TE)) 순으로 당도가 높게 나타났다. \( \mathrm { TS } \) 가 \( \mathrm { S } \) 보다 약 0.2(brix) 정도 낮게 나왔으나, 유의적인 차이는 없었다. 다쿠아즈 제조 시 첨가되는 설탕 및 분당(powdered sugar)과 대체감미료가 당도 결과에 영향을 주었다. T, TS, TE 순으로, 설탕 첨가량이 감소함에 따라 당도 값도 감소하는 경향을 보였다. Lee 등(2008)은 알코올 유래당인 자일리톨과 설탕을 \( 1: 1 \) 로 첨가하여 제조한 식빵과 설탕만으로 제조한 식빵과 유사한 당도를 나타내었고, 자일리톨만으로 제조한 식빵은 낮은 당도를 나타냈다고 보고하였다.</p> <p>Fujimaru 등(2012)은 감미료는 농도에 따라 단맛이 증가하는 경향은 달랐으나, \( 5 \% \) 의 설탕물과 비교 하였을 때 타가토스는 \( 5.6 \% \), 에리스리톨 \( 8.7 \% \) 의 농도일 때 설탕과 같은 농도를 나타냈다고 보고하였다. 설탕의 비율이 높았던 \( \mathrm { S } \) 와 \( \mathrm { T } \) 의 당도 값이 유사하게 높은 값을 나타내었고, \( \mathrm { TS } , \mathrm { TE } \) 는 유의적으로 낮은 값을 나타내었는데, 이는 타가토스와 에리스리톨이 가지는 구조적인 차이로 인한 결과로 사료된다. 당도계는 재료를 물에 녹여, 물에 녹은 물질 (무기질, 설탕, 아미노산, 수용성 물질 등)이 굴절시켜 용매 내 존재하는 물질의 량을 brix 단위로 나타내는 원리로 해석되는데, 2분자 화합물인 설탕(M.W: \( 342.3 \mathrm { ~g } ) \) 과 1분자 화합물인 타가토스 \( (180.2 \mathrm { ~g } ) \) 와 에리스리톨 \( (122.1 \mathrm { ~g } ) \) 간의 크기 차이로 인해 위와 같은 결과가 나온 것으로 보인다.</p>	[ "구운 다쿠아즈를 학생 15명을 대상으로 관능평가를 실시하였고, 결과는 통계처리하여 평균 \\( \\pm \\) 표준편차로 측정하였고, SPSS 프로그램을 이용해 대체감미료에 차이를 둔 다쿠아즈의 특성에 대한 통계적 유의성을 one-way ANOVA로 측정하였다. 그 결과, 당도는 대조군(설탕, \\( \\mathrm { S } \\) )이 가장 높았고, 실험군 1(타가토스, T), 실험군 2(타가토스 + 전분, TS), 실험군 3(타가토스 + 에리스리톨 \\( + ( \\) 타가토스 + 에리스리톨 \\( + \\) 전분, TE))순서로 나타났다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1a79-43db-bf7e-c1cdf862b954_07	생명LA	타가토스와 에리스리톨로 제조한 다쿠아즈의 물리화학적 특성 연구	<h2>관능평가(sensory evaluation)</h2> <p>다쿠아즈의 관능평가는 호서대학교 학생 중 자원자 15명을 선발하고 이들에게 관능평가 방법을 교육시킨 후 제조한 다쿠아즈를 평가하도록 하였다. 다쿠아즈의 평가항목인 색(color), 향(flavor), 맛(taste), 질감(texture), 전체적 기호도(overall acceptance)의 5가지의 항목에 대하여 설명하고, 1에서5 점까지의 척도를 사용한 채점 척도 시험법을 사용하여 평가하였다. 평가자들에게 물을 제공하여 다쿠아즈 시식 전, 시식 후 입안을 헹구고 평가하도록 지도하였다.</p> <p>관능평가의 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 전체적 기호도는 \( \mathrm { S } \) \( >\mathrm { T } >\mathrm { TS } >\mathrm { TE } \) 로 \( \mathrm { S } \) 와 \( \mathrm { T } \) 그리고 \( \mathrm { TS } , \mathrm { TE } \) 간에 유사한 경향을 보였다. 색상평가 결과 \( \mathrm { S } \) 가 높았고 \( \mathrm { TE } \) 가 가장 낮았지만, 군들간의 차이는 \( 0.2 \) 로 미미한 차이를 보였다. 향미의 평가 결과 \( \mathrm { S } \) 가</p> <p>가장 높았고, \( \mathrm { TS } \) 가 가장 낮았다. 다쿠아즈를 굽는 과정에서 설탕이 향미가 타가토스나 에리스리톨에 비하여 좋은 풍미를 나타내어 위와 같은 결과가 나온 것으로 사료된다. 맛 평가의 경우 \( \mathrm { S } \) 가 가장 높았지만, \( \mathrm { T } \) 와의 차이가 약 0.07점인 것으로 보아 설탕으로 제조한 다쿠아즈와 타가토스로 제조한 다쿠아즈 간의 맛 차이가 거의 없는 것으로 확인되었다. TS는 분당 대신 타가토스가 들어가있고, 결과적으로 T보다 더 많은 양의 타가토스가 들어가 있다. 설탕은 타가토스보다 더 단맛을 내므로 TS가 \( \mathrm { T } \) 보다 맛에 대한 평가가 낮은 것으로 사료되며, \( \mathrm { TE } \) 의 경우 평가 가장 낮았는데, 에리스리톨의 특성상 단맛은 입 속에 남지 않고 상쾌한 맛을 나타내므로 점수가 낮은 것으로 보인다. 또한 조직감의 경우 \( \mathrm { T } \)가 가장 높았으며, \( \mathrm { TE } \)가 가장 낮았다. \( \mathrm { TE } \)의 경우 에리스리톨은 결정성이 우수하고 흡습되기 어려운 성질을 가지기 때문에 \( ( \mathrm { Oh } \) 와 Choi 2002) 수분량이 줄어들어 조직이 경화되어 단단하므로 조직감에서 낮은 평가를 받은 것으로 사료된다.</p>	[ "\\( \\mathrm { S } \\) 와 \\( \\mathrm { T } \\) 그리고 \\( \\mathrm { TS } , \\mathrm { TE } \\) 간에 유사한 경향을 보였고, \\( \\mathrm { TE } \\)의 경우 에리스리톨은 결정성이 우수하고 흡습되기 어려운 성질을 가지기 때문에 (Oh 와 Choi 2002) 수분량이 줄어들어든다." ]
55e-0c9-merge_28a7cd33-1a79-43db-bf7e-c1cdf862b954_08	생명LA	타가토스와 에리스리톨로 제조한 다쿠아즈의 물리화학적 특성 연구	<p>전체적인 결과로는 \( \mathrm { TE } \)는 향미를 제외한 각 항목마다 가장 낮은 수치를 보였으며, \( \mathrm { S } \)와 \( \mathrm { T } \)는 향미와 조직감을 제외한 모든 관능평가에서 유사한 높은 점수를 받았다. TS는 각 항목에서 향미를 제외하고 TE보다 높은 점수를 받았다. 에리스리톨로 제조한 다쿠아즈에 비하여 타가토스로 제조한 다쿠아즈가 색, 향, 맛, 질감 및 전체적 기호도 평가에서 높은 값을 나타내는 것으로 보아 타가토스가 다쿠아즈 제조에 적합한 대체감미료로 사료되며, T는 \( \mathrm { S } \) 와 비교하였을 때 관능평가에서는 유사한 평가를 받았으나, 대체 감미료가 차지하는 비율이 약 \( 33.3 \% \) 이므로, 대체 감미료 비율이 \( 95.1 \% \) 로 높았던 TS로 제조된 다쿠아즈가 당뇨병 환자나 대사성 증후군을 겪고 있는 환자에게 적합한 것으로 사료된다.</p> <h1>초 록</h1> <p>우리나라의 경우 서구화된 식생활과 식습관으로 인하여 케이크류, 비스킷류 등의 다양한 서양식 제과를 접하게 되었다. 하지만 제과의 특성상 주재료인 설탕을 넣어 제조하고 열량과 당지수가 높아져 당뇨병환자들에게는 제한 될 수 밖에 없다. 그래서 본 연구에서는 설탕을 타가토스와 에리스리톨로 대체한 다쿠아즈를 제조하여, 물리화학적인 특성과 관능평가를 통하여 열량과 당지수가 높은 제과의 단점을 보완하고자 하였다.</p> <p>실험 결과 비중의 경우 \( \mathrm { TE } \) 가 가장 높은 값을 나타내었으나 군들간에 유의적인 차이를 보이지 않았으므로, 다쿠아즈 제조시 부피(품질)에 영향을 미치지 않은 것으로 보였다. 퍼짐성에서는 비중의 결과와 유사하였고, 손실률에서는 \( \mathrm { S } \) 가 가장 높은 값을 나타내었는데, 설탕의 함량이 높을수록 높은 손실률을 나타내었다. 색도의 경우 명도와 황색도 값은 \( \mathrm { S } \) 가 가장 높았고, 적색도 값은 타가토스가 첨가 되었던 \( \mathrm { TS } \) 와 \( \mathrm { T } \) 가 높았다. 당도의 경우 \( \mathrm { S } \) 가 가장 높았고 \( \mathrm { TE } \) 가 가장 낮았으며, \( \mathrm { T } \) 는 \( \mathrm { S } \) 와 \( \mathrm { TE } \) 사이 값을 나타내었고, 열량에서는 당도 결과와 유사한 양상을 보였다. 마지막으로 관능평가에서 \( \mathrm { T } \) 가 향미와 조직감을 제외한 모든 평가에서 \( \mathrm { S } \) 와 유사한 결과를 나타내었으며, \( \mathrm { TE } \) 가 가장 낮은 평가를 받은 것으로 나타났다.</p> <p>대체감미료를 사용하여 제조한 다쿠아즈의 물리적 특성 실험 결과, 에리스리톨 함유 다쿠아즈(TE)는 손실률과 열량에서 가장 좋은 결과 값을 나타내었으나 관능평가에서 전체적으로 낮은 평가를 받았고, \( 38.3 \% \) 타가토스를 함유 다쿠아즈(TS)는 손실률과 열량이 낮고, 관능평가에서 TE보다 높은 점수를 받았다. \( 13.4 \% \) 타가토스로 제조한 다쿠아즈(T)는 설탕으로 제조한 다쿠아즈(S)와 물리적 특성 실험결과와 관능평가 결과가 유사했는데, 이는 유사한 설탕함량으로 인한 결과로 사료된다. 본 연구에서는 혈당 변화 실험은 하지 않았지만, 선행 연구에서 타가토스를 사용하여 초콜릿을 제조 하였을 때, 설탕을 사용한 대조군에 비해 유의적으로 혈당 상승을 억제시키는 효과가 있었으므로, 다쿠아즈도 같은 경향을 나타낼 것으로 사료된다. 나쿠아즈는 탄타가토스로 대체하여 제조한 다쿠아즈(TS)는 당뇨병환자의 간식으로 제공될 수 있다. 또한 혈당 상승 억제 효과가 뛰어나고 당지수가 낮은 타가토스로 제조한 다쿠아즈를 제품화할 경우, 당뇨병환자뿐만 아니라 비만이거나 혈당조절이 필요한 환자의 간식으로 적절하므로, 혈당 조절과 체중증가 억제 효과가 있는 다쿠아즈를 섭취할 수 있는 기회를 제공할 것으로 사료된다.</p>	[ "\\( \\mathrm { S } \\)와 \\( \\mathrm { T } \\)는 향미와 조직감을 제외한 모든 관능평가에서 유사한 높은 점수를 받고, 대체감미료를 사용하여 제조한 다쿠아즈의 물리적 특성 실험 결과, 에리스리톨 함유 다쿠아즈(TE)는 손실률과 열량에서 가장 좋은 결과 값을 나타내었으나 관능평가에서 전체적으로 낮은 평가를 받았고, \\( 38.3 \\% \\) 타가토스를 함유 다쿠아즈(TS)는 손실률과 열량이 낮고, 관능평가에서 TE보다 높은 점수를 받았으며, 혈당 상승 억제 효과가 뛰어나고 당지수가 낮은 타가토스로 제조한 다쿠아즈를 제품화할 경우, 혈당 조절과 체중증가 억제 효과가 있는 다쿠아즈를 섭취할 수 있는 기회를 제공할 것으로 사료된다." ]
55e-0c9-2e6e48c5-15b6-4411-b7d6-764b3ad63f04	생명LA	식용 식물추출물의 구강 세균에 대한 항균 활성	<h2>히비스커스 추출물의 항균 활성의 안정성</h2> <p>Table \( 3 \)에서 보듯이 히비스커스 꽃으로부터 얻어진 \( 70 \% \) 에탄올 추출물이 구강 세균의 생장을 효과적으로 저해하는 것으로 나타나 히비스커스 추출물을 대상으로 \(\mathrm{pH}\)와 온도에 대한 안정성을 확인하였다.</p> <p>히비스커스 꽃 추출물에 들어있는 항균 활성 물질을 구강 위생용 생리활성 소재로 활용하기 위해서는 \(\mathrm{pH}\)와 열에 대한 안정성이 높아야 한다. 히비스커스 추출물의 \(\mathrm{pH}\)를 각각 \( 3,5,7 \) 및 \(9\)로 조절하여 \( 25~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(3\)시간 동안 방치한 후 원래 \(\mathrm{pH}\)로 다시 조절하여 최소저해농도를 측정한 결과는 다음과 같다.</p> <p>S. mutans의 경우 \( \mathrm{pH} ~3 \)에서는 히비스커스 추출물의 MIC값이 \( 5,000~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)이었으나 \( \mathrm{pH}~ 5 \) 이상일 경우 MIC값이 \(20,000 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)으로 나타나 항균 활성이 감소하는 것으로 나타났다. S. epidermidis에 대한 MIC값은 \( \mathrm{pH} ~ 3-7 \) 범위에서 각각 \( 625 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)로 안정하게 유지되었지만, \( \mathrm{pH} ~ 9\)에서는 MIC값이 \(5,000 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)로 나타나 항균 활성이 알칼리 조건에서 낮아지는 것으로 나타났다.</p> <p>E. coli에 대한 MIC값은 \( \mathrm{pH} ~3-7 \) 범위에서 \( 1,250 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)로 안정하게 유지되었지만, \( \mathrm{pH} ~9 \)에서는 MIC값이 \( 2,500 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)로 나타나 항균 활성이 감소하였다.</p> <p>L. casei와 K. pneumoniae에 대한 MIC값은 각각 \(10,000\)와 \( 1,250 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)로 나타나 \( \mathrm{pH} ~3-9\)의 넓은 \( \mathrm{pH} \) 범위에서도 항균 활성이 안정하게 유지됨을 확인하였다.</p> <p>이상으로 히비스커스 추출물의 항균 활성은 산성 조건에서 가장 안정하게 유지됨을 알 수 있었으며, 이는 히비스커스가 특유의 신맛과 유기산을 함유하고 있어서 재료 본래의 \( \mathrm{pH} \)가 낮아 산성에 더 안정한 것으로 판단된다. 구강청결제, 치약 등의 구강 청결 제품은 다양한 \( \mathrm{pH} \) 범위의 제품이 존재하며, 히비스커스 추출물이 그 중 약산성 제품의 항균소재로 적용될 경우 안정한 항균 활성을 유지할 수 있을 것으로 사료된다.</p> <p>또한 히비스커스 추출물을 각각 \( 4,25,50 \) 및 \( 75~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(30\)분간 방치한 후 최소저해농도를 측정한 결과, 모든 균이 \( 4-75~^{\circ} \mathrm{C} \)까지의 넓은 온도 범위에서 일정한 MIC값을 나타냈다. 그 값은 S. mutans, L. casei, S. epidermidis, K. pneumoniae 및 E. coli에서 각각 \( 5,000,10,000,625,1,250 \) 및 \( 1,250 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)으로 나타났으며, 이에 따라 히비스커스 추출물은 열에 안정한 것으로 사료된다.</p> <p>이상으로 히비스커스 꽃 추출물의 항균 물질은 열 안정성이 우수하고 산성 조건에서 안정한 것으로 확인되어 향후 구강용품 및 연관 제품에 적용할 경우 활용성이 높을 것으로 사료된다.</p>	[ "표 3에 나타낸 바와 같이, 히비스커스 꽃에서 추출한 \\( 70 \\% \\) 에탄올 추출물은 구강 내 박테리아 성장을 유의하게 억제하는 것으로 나타났습니다. 또한 히비스커스 추출물은 \\(\\mathrm{pH}\\)와 온도 조건 모두에서 안정성을 나타내어 실제 응용 가능성을 나타냅니다. 무궁화 추출물의 항균 활성은 산성 조건에서 안정적으로 유지되는 것으로 관찰되었습니다. 추출물은 낮은 \\(\\mathrm{pH}\\)로 인해 산성 환경에서 더 높은 수준의 안정성을 나타냈으며 히비스커스 꽃 추출물에서 발견되는 항균 물질은 우수한 열 안정성을 나타내며 산성 조건에서 안정적으로 유지됩니다. 이러한 특성으로 인해 향후 구강 관리 제품 및 관련 품목의 잠재적 응용 분야에 매우 가치가 있습니다." ]
55e-0c9-34c77a55-ff31-46cb-a47d-032c4c9ce9b0	생명LA	식용 식물추출물의 구강 세균에 대한 항균 활성	<h1>서 론</h1> <p>미생물과 쉽게 접촉하는 신체 부위인 구강은 적절한 온도, 습도 및 음식물 잔사등으로 인해 미생물의 생육에 좋은 환경을 제공해주며, 구강 내에서는 700여 종의 다양한 세균이 존재하는 것으로 보고되어 있다. 그 중에는 충치의 원인균으로 널리 알려진 Streptococcus mutans와 Lactobacillus casei, 구강 인두와 피부에 상주하며 화농성 염증을 유발하는 Staphylococcus epidermidis, 휘발성 황화합물을 생성하여 구취를 유발하는 Klebsiella pneumonia 등이 대표적인 구강세균으로 알려져 있다. 구강 질환은 충치(dental caries, 치아우식증), 구내염, 치주염 등 입안에서 생기는 병을 일컫는데, 특히 충치는 구강 질환 중 가장 문제가 되는 감염병으로 치아표면의 파괴를 동반한다. 대표적인 충치 유발균인 Streptococcus mutans는 치아 표면에서 glucosyltransferase의 촉매 작용으로 음식물의 sucrose를 분해하여 acetic acid 및 citric acid 등의 산을 생성하고, 이는 치아 에나멜층의 hydroxyapatite를 부식하여 치아 표면을 손실시킨다.</p> <p>충치 유발균을 포함하는 구강 세균의 억제에 penicillin 및 erythromycin과 같은 항생제가 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 항생제에 대한 내성 문제로 실제로는 잘 사용되지 않는다. 또한 항생제의 과도한 사용은 구강 미생물 뿐만 아니라 우리 몸에 유익한 장관 미생물 균총에도 악영향을 줄 수 있다. 이외에도 구강 세균을 억제하기 위해 불소 화합물이 함유되어 있는 구강청결제와 치약 등의 의약외품이 사용되고 있는데 일부 성분에 대한 안전성 이슈와 논란이 보고되고 있다.</p> <p>따라서 인간에게 독성이 없거나 적으면서 안정성이 높은 구강용 항미생물 소재의 개발이 요구되어 충치 유발균의 증식을 억제하는 방법, 충치균이 분비하는 glucan 합성 효소인 glucosyltransferase의 활성을 저해하는 방법, 충치 유발균이 이용하기 쉬운 sucrose를 대체하는 감미료를 사용하는 방법 등이 알려져 있다. 또한 식물추출물을 대상으로 구강 관련 천연 소재를 탐색하는 연구가 꾸준히 진행되고 있으며, 그 대표적인 예로 감국, 황련 및 솔잎 추출물은 충치균의 생장을 억제한다고 알려졌고, 오미자와 연 추출물은 구강 세균의 성장 억제와 구취 제거에 효과적임이 보고되었다.</p> <p>본 연구에서는 35종의 식용 식물을 대상으로 구강 세균에 대한 항균 활성을 측정하여 히비스커스(Hibiscus sabdariffa) 추출물이 가장 효과적인 것을 확인하였다. 히비스커스는 열대아시아 및 서아프리카가 원산지인 무궁화속 아욱과의 식물이며 보통 물로 추출하여 음용하는데, 그 추출물에는 사과산, 구연산 등이 들어있어 신맛을 가지며 안토시아닌계 색소로 인해 밝은 적색을 나타낸다. 또한 히비스커스에는 비타민 C가 풍부하고 칼륨, 칼슘, 철, 마그네슘 등의 무기질이 많이 함유되어 있으며, 기능성 성분으로는 플라보노이드계 물질인 gossypectin이 알려져 있다. 히비스커스는 눈의 피로 회복, 소화기능 강화, 강장, 이뇨, 출혈 방지 및 비뇨기계 염증 완화 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있어 생리활성 소재로의 활용 가능성이 높은 식물이다. Kang 등의 연구에서는 피부 관련 미생물에서 히비스커스 에탄올 추출물의 항균활성을 확인한 바 있으며, 본 연구에서는 구강에 관련된 미생물에서의 항균활성을 확인하고자 한다.</p> <p>구강 미생물(Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, Staphylococcus epidermidis 및 Klebsiella pneumonia)에 대하여 항균 효과를 갖는 식물추출물을 탐색하여 가장 활성이 우수한 히비스커스를 구강용 항균 천연소재로 선정하였고, 또한 히비스커스 추출물의 항균 활성 및 항산화 활성을 평가하여 구강 위생용 생리활성 소재로의 개발 가능성을 검토하였다.</p>	[ "구강은 미생물이 쉽게 접촉하며, 적절한 온도와 습도, 음식물 잔사 등에 의해 이들의 번성에 유리한 조건을 제공한다. 이에 따라 구강 내에서는 약 700여 종의 세균이 살아 있다는 사실이 알려져 있다. 충치 발생 세균 등 구강 세균의 성장을 억제하는데 penicillin과 erythromycin과 같은 항생제가 유효하지만, 이들에 대한 내성 발생으로 실질적인 사용은 제한적이다. 반면 이번 연구에서는 35종의 식용 식물에 대한 항균 활성을 검토하였으며, 그 결과 히비스커스 추출물이 가장 큰 항균 효과를 보였다." ]
55e-0c9-ece1db3c-8e9b-4b41-bebb-3a75daf6c46d	생명LA	식용 식물추출물의 구강 세균에 대한 항균 활성	<h2>항균 활성 평가</h2> <p>항균 활성 평가는 Higasi의 방법과 같이 paper disc법을 이용하였으며, 계대배양을 통해 활성화시킨 균은 멸균 생리식염수에 현탁하여 \( 1 \times 10^{7} ~\mathrm{CFU} / \mathrm{mL} \)의 농도로 맞춘 후 실험에 사용하였다. 주입평판법에 따라 petri dish에 균 현탁액 \( 1~ \mathrm{mL} \)를 분주한 후 용해된 고체배지를 주입하여 사용하였다. 제조된 고체배지 위에 \( 8~ \mathrm{mm} \) filter paper disc를 놓고 진공농축한 \(5 ~\mathrm{brix} \)의 시료 \( 20 ~\mu \mathrm{L} \)를 흡수시킨 후 \( 37~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 24 \)시간 동안 배양하여 관찰하였다.</p> <p>최소저해농도(minimum inhibitory concentration, MIC) 측정은 추출물을 \( 0.45 ~\mu \mathrm{m} \) filter (Whatman International, England)를 이용하여 제균한 후 단계희석법(serial dilution method)을 통해 농도별 시료를 제조하여 사용했다. \( 96 \) well plate에 희석된 시료 \( 50~ \mu \mathrm{L} \)와 \( 1 \times 10^{5}-10^{6} ~\mathrm{CFU} / \mathrm{mL} \)로 희석한 균 현탁액 \( 50 ~\mu \mathrm{L} \)를 혼합한 뒤 균주별 증식용 배지 \( 150 ~\mu \mathrm{L} \)를 넣고 \( 24 \)시간 동안 배양한 후 microplate reader (VERSAmax, Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 흡광도를 측정하였고, 균체의 성장이 억제되어 탁도로 나타나지 않는 최소의 농도를 최소저해농도(MIC)로 정하였다.</p> <h2>항균 활성의 안정성 평가</h2> <p>산과 알칼리에 대한 항균 활성의 안정성 평가를 위해 농도별 히비스커스 추출물을 \( 1 ~\mathrm{N} ~\mathrm{NaOH} \) 또는 \( 1 ~\mathrm{N}~ \mathrm{HCl} \) 수용액을 이용하여 \( \mathrm{pH} \)를 \(3, 5, 7\) 및 \(9\)로 조정한 후 \( 25~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(3\)시간 방치하였다. 이후 본래의 \( \mathrm{pH} \)로 조절한 후 균 배양액을 첨가하여 최소저해농도를 측정함으로써 \( \mathrm{pH} \)에 대한 안정성을 평가하였다. 온도에 대한 안정성은 농도별 히비스커스 추출물을 \( 4, 25, 50 \) 및 \( 75~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(30\)분간 방치한 후 균 배양액을 첨가하여 확인된 최소저해농도를 측정하여 확인하였다.</p> <h2>항산화 활성 평가</h2> <p>총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis assay법으로 Lee 등의 방법을 변형하여 분석하였다. 시료 희석액 \( 100 ~\mu \mathrm{L} \)에 folin-ciocalteu 시약 \( 50 ~\mu \mathrm{L} \)를 첨가하여 혼합한 뒤 \(4\)분 동안 반응시키고, \( 20 \% ~\mathrm{NO}_{2} \mathrm{CO}_{3} \)를 \( 1.5 \mathrm{mL} \) 가하여 \(2\)분간 방치한 후 \( 760 ~\mathrm{nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. Chlorogenic acid를 총 폴리페놀 함량 분석의 표준물질로 선정하여 표준곡선으로부터 총 폴리페놀의 함량을 계산하였다. 총 플라보노이드 함량은 Kim 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 희석액 \( 0.5 ~\mathrm{mL} \)와 diethylene glycol \( 5~ \mathrm{mL} \)를 혼합한 후, \( 1 ~\mathrm{N} ~\mathrm{NaOH} \)를 \( 1 ~\mathrm{mL}\)씩 가하여 \( 37~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(1\)시간 동안 반응시킨 후 \( 420 ~\mathrm{nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 총 플라보노이드 함량 계산용 표준물질은 naringin을 사용하였다.</p> <p>DPPH 유리라디칼 소거능은 Heo 등의 방법을 변형하여 분석하였다. 메탄올에 \( 0.6 ~\mathrm{mM} \)의 농도로 희석한 DPPH 시약 \( 160~ \mu \mathrm{L} \)와 희석한 시료 \( 40~ \mu \mathrm{L} \)를 혼합하여 암소에서 \(30\)분간 방치한 후 \( 515~ \mathrm{nm} \)의 파장에서 흡광도를 측정하였다. 환원력은 Hazra 등의 방법을 변형하여 측정하였다. 시료 희석액 \( 1 ~\mathrm{mL} \)와 \( 10 ~\mathrm{mM} \) sodium phosphate 완충용액 \( (\mathrm{pH} \) 6.6) \( 1 ~\mathrm{mL} \)를 혼합한 후 \( 10 \% \) potassium ferricyanide \( 1 ~\mathrm{mL} \)를 첨가하여 \( 50~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \(20\)분 동안 반응시켰다. 반응액에 \( 10 \% \) trichloracetic acid를 \( 1 ~\mathrm{mL} \) 주입하고 원심분리(\(10,000\times \mathrm{g}\), 10분)를 하였다. 원심분리 상등액과 \( 0.1 \% \) ferric chloride를 각각 \( 100~ \mu \mathrm{L} \)씩 혼합하여 \(700 ~\mathrm{nm} \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>	[ "항균 활성 평가는 Higasi의 방법과 같이 paper disc법을 이용하였으며, 최소저해농도(MIC) 측정은 추출물을 제균한 후 단계희석법을 통해 농도별 시료를 제조하여 사용했다. 또한, \\( \\mathrm{pH} \\)에 대한 안정성 평가는 본래의 \\( \\mathrm{pH} \\)로 조절한 후 균 배양액을 첨가하여 최소저해농도를 측정하였고, 총 폴리페놀 함량 측정은 Folin-Denis assay법으로 Lee 등의 방법을 변형하여 분석하였다. 마지막으로 DPPH 유리라디칼 소거능은 Heo 등의 방법을 변형하여 분석하는 등 다양한 방법을 사용하였다." ]
55e-0c9-129e3d04-976a-4b3a-9193-161988ef45b6	생명LA	식용 식물추출물의 구강 세균에 대한 항균 활성	<h2>히비스커스 추출물의 폴리페놀 함량 및 항산화 활성</h2> <p>폴리페놀은 화학 구조에 따라 플라보노이드계와 비플라보노이드계로 구분되는 생리활성 물질로 항산화, 항염증 및 항돌연변이 활성뿐만 아니라, 특히 강력한 항균 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 히비스커스 추출물의 총 폴리페놀 함량은 \( 130.5 ~\mathrm{mg} / \mathrm{g} \)이었고, 총 플라보노이드 함량은 \( 25.7~ \mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 나타났다(Table \( 4 \)). 이 결과는 Kim과 Jin의 연구에서 히비스커스의 총 폴리페놀 함량이 \( 131.8 ~\mathrm{mg} / \mathrm{g} \)이라는 결과와 거의 유사하였고, 플라보노이드 함량의 경우에는 Lee 등이 보고한 흰무궁화 꽃의 플라보노이드 함량( \( 47.74~ \mathrm{mg} / \mathrm{g}) \)에 비해 다소 낮게 나타났다. 실제로 카테킨과 플라보노이드계 등의 폴리페놀 화합물이 상당량 들어있는 것으로 알려진 차잎의 폴리페놀 함량(건조 중량 대비 \(10-25\%\))과 비교해서도 히비스커스 추출물의 폴리페놀 함량은 비교적 높은 수준으로 볼 수 있다.</p> <p>히비스커스 꽃 추출물의 DPPH 유리라디칼 소거활성과 Ferrous 이온에 대한 환원력을 확인하였다. 히비스커스 추출물은 농도 증가에 비례하여 DPPH 라디칼을 효과적으로 소거하였다(Fig. \(1\)). 히비스커스 추출물은 \( 500~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 농도에서 \( 86.1 \% \)의 유리라디칼을 소거하였고, DPPH 유리라디칼을 \( 50 \% \) 소거하는 농도인 \( \mathrm{EC}_{50} \)값은 \( 246.7~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)으로 나타나 히비스커스 추출물은 유리라디칼 소거 항산화 능력이 우수함을 알 수 있었다. 이와 같은 결과는 Shin과 Ha의 연구에서 알려진 무궁화 추출물의 DPPH 유리라디칼 소거활성과 유사하였다. 히비스커스 추출물의 환원력도 농도에 비례하여 증가하였고(Fig. \(2\)), 반응액의 흡광도가 \( 0.5 \)에 달하는 농도인 \( \mathrm{RC}_{0.5} \)값은 \( 490.0~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)으로 나타났다. 이는 백연수잎 추출물의 \( \mathrm{RC}_{0.5} \)값인 \( 250.0~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)보다는 높았으나 복분자 추출물의 \( \mathrm{RC}_{0.5} \)값인 \( 840.0~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)보다는 크게 낮아 환원력이 우수함을 알 수 있었다.</p> <p>이상의 결과로부터 \(35\)종의 식용 식물 중 히비스커스, 오미자, 레몬, 모과, 몰약, 및 단삼 추출물이 구강 세균에 대한 항균 소재로 선별되었고, 그 중 항균 스펙트럼 및 항균 활성이 가장 우수한 히비스커스 추출물을 구강 세균용 항균 및 생리활성 소재로 최종 선발하였다. 히비스커스 추출물은 상당량의 폴리페놀과 플라보노이드 화합물을 함유하고 있었고, 높은 항산화 활성을 보여주었다. 따라서 히비스커스 추출물은 구강용 항균 및 항산화 활성을 가진 기능성 원료로 활용가능성이 높을 것으로 사료되며, 향후 히비스커스 추출물의 추출 조건 최적화 및 구강용품에 적용한 연구에 대해 검토할 필요가 있다.</p> <h1>초 록</h1> <p>식용 식물 \(35\)종의 생리활성 부위를 대상으로 \( 70 \% \) 에탄올 추출물의 구강 세균(Streptococcus mutans, Lactobacillus casei, Staphylococcus epidermidis, Klebsiella pneumoniae)에 대한 항균 활성을 확인하였다. \(35\)종의 식물추출물 중 항균 스펙트럼이 가장 넓고 최소저해농도가 낮은 히비스커스 꽃 추출물을 구강 세균에 대한 항균 소재로 최종 선발하였다. 히비스커스 추출물의 항균 활성은 산성 조건에서 안정하였고, 열 안정성이 우수하였다. 히비스커스 추출물의 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량은 \(130.5\) 및 \( 25.7 ~\mathrm{mg} / \mathrm{g} \)으로 나타났고, 유리라디칼 소거활성과 환원력의 항산화 활성이 우수하였다.</p>	[ "식용 식물 35종의 생리활성 부위를 대상으로 \\( 70 \\% \\) 에탄올 추출물의 구강 세균에 대한 항균 활성을 확인하였으며 그 중, 항균 스펙트럼이 가장 넓고 최소저해농도가 낮은 히비스커스 꽃 추출물을 구강 세균에 대한 항균 소재 식물추출물로 최종 선발하였다. 화학 구조에 따라 플라보노이드계와 비플라보노이드계로 구분할 수 있는 폴리페놀은 생리활성 물질로 항산화, 항염증, 항돌연변이 활성을 가진다. 특히 강력한 항균 효과를 갖고 있는데 차잎(카테킨과 플라보노이드계 등의 폴리페놀 화합물을 상당히 함유)의 폴리페놀 함량과 견주어 보아도 히비스커스 추출물의 폴리페놀 함량은 비교적 높은 수준이다." ]
55e-0c9-c6b6b9bf-e0bb-4678-89cc-7ecdcfaf12e4	생명LA	식용 식물추출물의 구강 세균에 대한 항균 활성	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험재료</h2> <p>본 실험의 식용 식물 원료 \( 35 \)종은 대형마트 또는 한약소재 전문 쇼핑몰을 통하여 구매하여 사용하였고, 식물 원료의 사용부위와 원산지는 Table \( 1 \)과 같다. 건조 상태의 재료는 그대로 추출에 사용하였고, 생물 상태의 재료는 흐르는 수도수를 이용하여 세척하고 열풍건조기(Taeyang Electric Co., Goyang, South Korea)를 이용하여 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 24-48 \)시간 동안 건조 과정을 거친 후 실험에 사용하였다.</p> <p>추출 용매인 정제수와 에탄올은 Burdick & Jackson사 (Muskegon, MI, USA)의 HPLC급 제품을 사용하였고, 기능성 평가에 사용된 folin-ciocalteu, \( 1,1 \)-diphenyl-\( 2 \)-picrylhydrazyl (DPPH) 시약과 표준물질로 사용된 chlorogenic acid, naringin, ascorbic acid는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)의 제품을, 그 외 시약은 \( 1 \)급 이상을 사용하였다.</p> <h2>균주 배양</h2> <p>본 연구에서 사용한 균주는 \(4\)종의 구강세균 Streptococcus mutans KCTC \(3065\), Lactobacillus casei KCTC \( 3109 \), Staphylococcus epidermidis KCTC \( 1917 \), Klebsiella pneumoniae KCTC \( 2208 \)과 위생지표균 Escherichia coli KCTC \( 2441 \)으로, 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, Jeongeup, South Korea)에서 분양 받아 사용하였다. Streptococcus mutans KCTC \( 3065 \)는 Brain Heart Infusion 배지에서, Lactobacillus casei KCTC\( 3109 \)는 Lactobacilli MRS Broth 배지에서 배양하였다. Staphylococcus epidermidis KCTC \( 1917 \)와 Klebsiella pneumoniae KCTC \( 2208 \)와 Escherichia coli KCTC \(2441\)는 Nutrient Broth 배지를 사용하여 배양하였다. 다섯 종의 균 모두 \( 37~^{\circ} \mathrm{C} \)로 셋팅된 진탕 배양기(VS-\(8480\)SFN, VISION Scientific, Daejeon, South Korea)를 사용하여 호기성 조건에서 배양하였으며, \( 24 \)시간 또는 \( 48 \)시간 동안 배양하여 \( 1 \times 10^{7}~ \mathrm{CFU} / \mathrm{mL} \)의 균을 항균 활성 분석에 사용하였다.</p> <h2>식용 식물추출물의 제조</h2> <p>건조된 시료 \( 20 ~\mathrm{g} \)에 \( 70 \% \) 에탄올을 \( 100 ~\mathrm{mL} \)씩 가하여 실온에서 \( 24 \)시간 추출한 후 같은 양의 용매를 다시 가하여 \( 60~^{\circ} \mathrm{C} \)에서 \( 4 \)시간 동안 진탕추출하였다. 추출물은 Whatman No. \( 1 \) 여과지로 여과한 뒤 감압농축기(Eyela, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축한 후, 당도계(Master refractometer, Atago, Tokyo, Japan)를 사용하여 \( 5 ~\mathrm{brix}\) 농도로 제조하였다.</p>	[ "실험에 사용하는 재료는 건조 상태 재료는 그대로 추출해 사용하였고, 생물 상태 재료는 흐르는 수도수를 이용하여 세척하고 열풍건조기로 \\( 40^{\\circ} \\mathrm{C} \\)에서 24-48시간 동안 건조하여 사용하였으며, 균 다섯 종 모두 \\( 37^{\\circ} \\mathrm{C} \\) 진탕 배양기로 호기성 조건에서 24시간 혹은 48시간 배양하여 분석하였다. 건조 시료에 에탄올을 가하여 실온에서 24시간 추출한 후 같은 양의 용매를 다시 가하여 4시간 동안 진탕추출한 추출물을 여과하여 감압농축기로 농축하고, 당도계를 사용하여 \\( 5 ~\\mathrm{brix}\\) 농도로 제조하였다." ]
55e-0c9-823f20f1-78f6-4d02-8a6c-c5bb6bde06f5	생명LA	식용 식물추출물의 구강 세균에 대한 항균 활성	<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Paper disc assay에 의한 식용 식물추출물의 항균 활성</h2> <p>식용 식물 \( 35 \)종의 생리 활성 부위를 \( 70 \% \) 에탄올로 추출하여 구강 세균에 대한 항균 효과를 확인하였다. Table \( 2 \)는 여러 식용 식물추출물의 paper disc assay 결과를 나타낸 것으로, 당귀, 박하, 자소엽, 캐모마일, 고삼, 울금, 레몬그라스, 라벤더, 칡, 매리골드, 헛개나무, 달래, 약도라지, 냉이 및 아로니아 추출물은 구강 세균인 S. mutans, L. casei, S. epidermidis, K. pneumoniae 와 보건지표군인 E. coli에 대한 항균 효과가 전혀 없었다.</p> <p>엄나무, 블루베리 및 석류 추출물은 S. epidermidis에 대해, 구기자 및 당근 추출물은 K. pneumonia에 대해 낮은 항균 활성을 보였다. 루이보스와 페퍼민트 추출물은 S. mutans와 S. epidermidis에 대해, 어성초, 계피, 로즈힙 및 자몽 추출물은 S. epidermidis와 K. pneumonia에 대해, 황백 추출물은 S. mutans와 L. casei의 두 종류의 균에 대한 항균 활성을 나타냈다. 모과, 감초 및 몰약 추출물은 그람양성균인 S. mutans와 S. epidermidis, 그람음성균인 K. pneumonia에 대해, 단삼 추출물은 그람양성균인 L. casei와 S. epidermidis, 그람음성균인 K. pneumonia에 대해 항균 활성을 나타내었다. 특히 히비스커스, 오미자 및 레몬 추출물은 그람양성균인 S. mutans와 S. epidermidis, 그람음성균인 K. neumoniae와 E. coli에서 clear zone이 관찰되어 넓은 항균 스펙트럼과 높은 항균 활성을 보였다. 오미자의 경우 S. epidermidis에 대하여 \( 25 \mathrm{~mm} \)로 가장 큰 저해환을 나타냈다. Jeong 등의 결과에 비하여 높은 항균 활성을 보였는데, 이는 추출 용매의 차이에 기인한 것으로 물보다 \( 70 \% \) ethanol이 구강 세균에 대한 비극성 항균 물질을 더 많이 추출할 수 있기 때문인 것으로 판단된다.</p> <p>본 연구에서 스크리닝 대상으로 선정한 식물 유래 추출물 \( 35 \)종 중 \( 4 \)종의 구강 세균에 대하여 항균 스펙트럼이 넓고 항균 활성이 높은 히비스커스, 오미자, 레몬, 모과, 몰약, 단삼 추출물을 \( 1 \)차 선별하였으며, 최소저해농도(MIC) 측정을 통해 구강 세균에 대한 생장 저해능을 확인하였다.</p> <h2>식용 식물추출물의 최소생육저해농도(MIC)</h2> <p>Table \(3\)과 같이 히비스커스, 오미자, 레몬 및 모과의 \( 70 \% \) ethanol 추출물은 충치균인 S. mutans에 대해 생장 저해능을 보였는데 이 중에서 히비스커스 추출물이 가장 낮은 MIC 값( \(5 ~\mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \)을 나타냈다. Lee와 Kim의 연구는 콩 추출물이 \( 40 ~\mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 이상의 농도에서 S. mutans의 생장을 억제하였다고 보고한 바 있는데, 본 연구에서는 히비스커스 추출물의 S. mutans 에 대한 항균 활성이 콩 추출물보다 더 높은 것으로 나타났다. L. casei에 대한 식물추출물의 MIC를 측정한 결과 Table \(3\)에서 보는 바와 같이 paper disc법으로 \(1\)차 스크리닝 시 육안 관찰에서 항균 활성을 보이지 않았던 히비스커스, 오미자, 레몬 및 모과에서 최소저해농도가 측정되었는데, 이는 MIC 측정 시 추출물에 함유되어 있는 유기산에 의해 배지의 \(\mathrm{pH}\)가 낮아져 항균 효과가 증가된 것으로 판단된다.</p> <p>S. epidermidis에 대한 식물추출물의 MIC를 측정한 결과, 모든 추출물이 균의 증식을 억제하였고, 그 중 오미자와 레몬 추출물이 가장 높은 저해능을 보였다\( (\mathrm{MIC}=156.3~ \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \). Lee 등은 S. epidermidis에 대한 레몬그라스 및 오렌지 에센셜 오일의 최소저해농도를 각각 \(5\) 및 \( 10 ~\mathrm{mg} / \mathrm{mL} \)로 보고한 바 있어, 본 연구에서 확인한 바, 히비스커스, 오미자, 레몬 및 단삼의 \( 70 \% \) ethanol 추출물( \( \mathrm{MIC}=0.156-2.5~ \mathrm{mg} / \mathrm{mL}) \)이 S. epidermidis에 대해 레몬그라스나 오렌지 에센셜 오일보다 더 높은 항균 효과를 가지는 것으로 판단된다.</p> <p>K. pneumoniae에 대한 추출물의 MIC를 측정한 결과, 히비스커스, 오미자, 레몬, 모과 및 몰약 추출물은 항균 능력이 있었으며, 그 중 히비스커스, 오미자 및 레몬이 모두 \( 1,250 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL} \)의 가장 낮은 MIC값을 나타냈다. Goo는 로즈마리 추출물과 세이지 추출물이 고형분 농도 \( 6 \% \) 이상에서 K. pneumoniae 의 증식을 억제하였다고 보고한 바 있는데, 이와 비교해서도 히비스커스, 오미자 및 레몬 추출물이 K. pneumoniae에 대한 항균 활성이 더 높은 것으로 보인다.</p> <p>대조군으로 사용된 보건지표균 E. coli에 대해서 히비스커스, 오미자 및 레몬 추출물이 생장 저해능을 보였는데 이 중에서 히비스커스가 가장 낮은 MIC값\( (1,250 ~\mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)을 나타냈다. Cho의 연구에서 산수유 추출물이 \( 2 ~\mathrm{mg} / \mathrm{mL} \) 이상의 농도에서 E. coli의 증식을 억제하는 최소저해농도 값을 나타냈다고 보고한 바 있으므로 히비스커스 추출물의 E. coli에 대한 항균 활성이 산수유 추출물보다 더 높은 것으로 판단된다.</p> <p>이상의 항균 활성 분석 결과로부터 항균 활성의 범위가 넓고, 구강 관련 위해균과 E. coli에 대하여 우수한 항균 활성을 나타내며 특히 충치균인 S. mutans에 대한 최소저해농도가 가장 낮은 히비스커스 추출물을 구강 미생물에 대한 항균 소재로 발굴하였다.</p>	[ "식용 식물 35종에서 추출한 \\( 70 \\% \\) 에탄올 추출물을 이용하여 구강 세균에 대한 항균 효과를 확인하였다. 이 중 4종인 히비스커스, 오미자, 레몬, 모과, 몰약, 단삼 추출물은 항균 활성이 높고 넓은 스펙트럼을 보여 1차 선별되었으며, 최소저해농도(MIC) 측정을 통해 구강 세균에 대한 생장 저해능을 확인하였다. 특히 충치균인 S. mutans에 대해 가장 낮은 최소저해농도를 나타내는 히비스커스 추출물은 구강 미생물에 대한 항균 소재로서 유망하게 발굴되었다. 이러한 결과로부터 항균 활성의 범위가 넓고 구강 관련 위해균과 E. coli에 대해 우수한 효과를 나타내는 식물 추출물을 발견하였다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-1c91-40de-8f85-4050912ba042_05	생명LA	국화(Chrysanthemum morifolium )꽃으로부터 Flavonoid의 분리 및 동정	<p>화합물 \(2 \)는 positive FAB-MS에서 \( m / z 307[ \mathrm { M } + \mathrm { Na } ] ^ { + } \) 의 분자이온 peak 가 관측되어 분자량을 \(284 \) 로 결정하였다. 화합물 \(1 \) 과 분자량이 \( 14 \mathrm { amu } \) 차이가 나는 것으로 부터 methyl 기가 한 개 더 존재함을 예상할 수 있었다. IR 스펙트럼으로부터 공역화 된 카보닐기 \( \left ( 1653 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), 수산기 \( \left ( 3259 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \) 와 이중결합 \( \left (1590 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \)이 있는 것으로 확인되었다. \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \) NMR \( \left (400 \mathrm { MHz } \right . \), pyridine- \( d_ { 5 } \), \( \left .a_ { 11 } \right ) \) 과 \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } \) NMR (100 MHz, pyridine- \( \left .d_ { 5 } , \delta_ {\mathrm { C } } \right ) \) spectrum을 통하여화합물 \(1 \) 과 같은 구조에 하나의 수산기 대신 methoxy \( \left ( \delta_ { 11 } \right . \) \( \left .3 \mathrm { H } , \mathrm { s } ; \delta_ {\mathrm { C } } 55.6 \right ) \) 기가 결합 했음을 알 수 있었다. Methoxy기의 결합위치를 확인하기 위해 \( \mathrm { gHMBC } \) 를 측정하였다. 그 결과 methoxyl의 proton signal \( \left ( \delta_ { 11 } 3.59 \right ) \) 이 \( \mathrm { C } -4 \) 의 oxygenated olefin quaternary carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . \) 162.5)과 cross peak 를 보여 \( \mathrm { C } -4 \) 에 methoxy기가 결합해 있음을 확인 하였다. 위의 data를 문헌 값(Malmir 등, \(2015 \))과 비교 하여 화합물 \(2 \) 를 \(5,7 \)-dihydroxy- \(4 \)-methoxyflavone, acacetin 으로 구조 동정 하였다.</p>	[ "화합물 1과 분자량이 14amu 차이가 나는, methyl 기가 한 개 더 존재함을 예상할 수 있는 화합물 2는 positive FAB-MS에서 \\( m / z 307[ \\mathrm { M } + \\mathrm { Na } ] ^ { + } \\)의 분자이온 peak가 관측되어 분자량을 284로 결정하였다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-1c91-40de-8f85-4050912ba042_04	생명LA	국화(Chrysanthemum morifolium )꽃으로부터 Flavonoid의 분리 및 동정	<h1>결과 및 고찰</h1> <p>화합물 \(1 \)은 negative FAB-MS 에서 \( m / z 269[ \mathrm { M } - \mathrm { H } ] ^ { - } \)의 분자이온 peak가 관측되어 분자량을 270 으로 결정하였다. IR 스펙트럼으로부터 공역화된 카보닐기 \( \left (1629 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), 수산기 \( \left (3427 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \) 와 이중결합 \( \left (1580 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \) 이 있는 것으로 확인되었다. \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \) NMR \( (400 \) \( \mathrm { MHz } \), pyridine- \( d_ { 5 } , \delta_ {\mathrm { H } } \) ) 스펙트럼에서 적분값이 \(2 \) 인 \(2 \) 개의 olefin methine proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } 7.85,2 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=8.0 \mathrm { ~Hz } ; \(7.17,2 \) \mathrm { H } \right . \), \( \mathrm { d } , J=8.0 \mathrm { ~Hz } \) )로부터 para-이치환 벤젠 구조가 존재함을 확인하였다. 또한 \(2 \) 개의 olefin methine proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } 6.80,1 \mathrm { H } \right . \), \( \mathrm { s } ; 6.70,1 \mathrm { H } , \mathrm { s } \) 으로부터 \( 1,2,3,5 \)-사치환 벤젠 구조가 존재함을 확인하였다. 또한 \(1 \) 개의 olefin methine proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } 6.82 \right . \), \( 1 \mathrm { H } , \mathrm { s } ) \) 을 관측하었으며, 이를 통해 이 화합물이 flavone 화합물 임을 예상하였다. \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } \) NMR \( \left (100 \mathrm { MHz } \right . \), pyridine- \( \left .d_ { 5 } , \delta_ {\mathrm { C } } \right ) \) 스펙트럼에서 탄소수가 \(15 \) 개임을 확인하였으며, 이를 통해 flavone 화합물임을 확인하였다. \(1 \)개의 conjugated ketone carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . \) 182.54), \( 5 \)개의 oxygenated olefin quaternary carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } 166.4 ; 164.3 ; 162.9 ; 162.5 ; 158.3 \right ) \) 을 확인하였고, \(2 \) 개의 olefin quaternary carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } 122.0 ; 116.7 \right ) \) 을 확인하였으며, \(7 \)개의 olefin methine carbon signal [ \( \delta_ {\mathrm { C } } 128.7 \) \( ( \times 2) \); \( 104.8( \times 2) \); 103.6; 98.7; 94.7]을 확인하였다. 위의 data를 문헌값(Wang 등, \(2015 \))과 비교하여 화합물 \(1 \)을 \( 5,7,4- \)trihydroxyflavone, apigenin으로 구조 동정 하였다.</p>	[ "화합물 1은 negative FAB-MS에서 m/z 269[M-H]^-의 분자이온 peak가 관측되어 분자량 270으로 결정되었고, IR 스펙트럼에서 공역화된 카보닐기 및 수산기와 이중결합이 확인되었으며,2개의 올레핀 메틴 양성자 신호로 부터 2치환 벤젠구조와 4치환 벤젠구조가 존재함을 확인하였다.문헌값과의 데이터비교를 통해 화합물 1을 구조 동정 하였다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-1c91-40de-8f85-4050912ba042_06	생명LA	국화(Chrysanthemum morifolium )꽃으로부터 Flavonoid의 분리 및 동정	<p>화합물 3은 negative FAB-MS 에서 \( m / z 431 \) [M-H]의 분자이온 peak가 관측되어 분자량을 \(432 \) 로 결정하였다. 화합물 \(1 \)과 분자량이 \( 162 \mathrm { amu } \) 차이가 나는 것으로부터 육탄당이 한 개 더 존재함을 예상할 수 있었다. IR 스펙트럼으로부터 공역화된 카보닐기 \( \left (1635 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), 수산기 \( \left (3345 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), 방향족 고리 \( (1605 \), \( 1512,1485 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \) )가 존재하는 것으로 확인되었다. \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \mathrm { NMR } \) \( \left (400 \mathrm { MHz } \right . \), pyridine- \( \left .d_ { 5 } , \delta_ {\mathrm { H } } \right ) \) 과 \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } \) NMR \( (100 \mathrm { MHz } \), pyridine- \( d_ { 5 } , \delta_ {\mathrm { C } } \) ) spectrum을 통하여 화합물 \(1 \) 과 매우 비슷한 구조에 당이 하나 더 결합했음을 알 수 있었다. 당에서 유래한 \(1 \)개의 hemiacetal signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } 101.6 ; \delta_ {\mathrm { H } } 5.82,1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=7.2 \mathrm { ~Hz } \right ), 4 \)개의 oxygenated methine signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } 78.4 ; 77.8 ; 74.8 ; 71.3 \right . \); \( \left . \delta_ {\mathrm { H } } 3.97 ; 3.48 ; 3.47 ; 3.15 \right ), 1 \) 개의 oxygenated methylene signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } 62.3 ; \delta_ {\mathrm { H } } 3.94,1 \mathrm { H } , \mathrm { dd } , J=12.0,1.6 \mathrm { ~Hz } ; \delta_ {\mathrm { H } } 3.74 \right . \), \( 1 \mathrm { H } , \mathrm { dd } , J=12.0,5.2 \mathrm { ~Hz } ) \) 의 chemical shift 및 anomer proton signal의 결합정수 \( (J=7.2 \mathrm { ~Hz } ) \) 로부터 당의 구조가 \( \beta \)-glucopyranose 임을 확인하였다. 당의 결합위치를 확인하기 위하여 \( \mathrm { gHMBC } \) 를 측정하였다. 그 결과 anomer proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } 5.82, \mathrm { H } -1 \right ) \) 이 C- \(7 \)의 oxygenated olefin quaternary carbon signal ( \( \left . \delta_ {\mathrm { C } } 166.4 \right ) \) 과 cross peak를 보여 glucose가 7번에 결합하고 있음을 알 수 있었다. 위의 data를 문헌값(Lee 등, 2013)과 비교하여 화합물 \( 3 \) 을 cosmetin으로 구조 동정 하였다.</p>	[ "gHMBC 측정을 통해 glucose가 7번 위치에 결합하고 있음을 확인하였으며, 이는 anomer proton signal과 oxygenated olefin quaternary carbon signal이 cross peak를 형성하는 것으로 확인되었다. 또한, 화합물 3의 분자량은 negative FAB-MS에서의 \\( m / z 431 \\) [M-H] 분자이온 peak 관찰을 통해 \\(432 \\)로 결정되었다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-1c91-40de-8f85-4050912ba042_07	생명LA	국화(Chrysanthemum morifolium )꽃으로부터 Flavonoid의 분리 및 동정	<p>화합물 4 는 positive FAB-MS에서 \( m / z 469[ \mathrm { M } + \mathrm { Na } ] ^ { + } \)의 분자 이온 peak가 관측되어 분자량을 446으로 결정하였다. 화합물 2 와 분자량이 \( 162 \mathrm { amu } \) 차이가 나는 것으로부터 육탄당이 한 개 더 존재함을 예상할 수 있었다. IR 스펙트럼으로부터 공역화된 카보닐기 \( \left (1656 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), 수산기 \( \left (3394 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), 방항족 고리 \( \left (3072 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \) 가 존재하는 것으로 확인되었다. \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \mathrm { NMR } (400 \mathrm { MHz } \), pyridine \( \left .d_ { 5 } , \delta_ {\mathrm { H } } \right ) \) 과 \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } \operatorname { NMR } \left (100 \mathrm { MHz } \right . \), pyridine \( \left .d_ { 5 } , \delta_ {\mathrm { C } } \right ) \) spectrum을 통하여 화합물 2 와 매우 비슷한 구조에 당이 하나 더 결합헸음 을 알 수 있었다. 당에서 유래한 1개의 hemiacetal signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . \) \( \left .101.6 ; \delta_ {\mathrm { H } } 5.82,1 \mathrm { H } , \mathrm { d } , J=7.2 \mathrm { ~Hz } \right ), 4 \) 개의 oxygenated methine signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } 78.4 ; 77.8 ; 74.8 ; 71.3 ; \delta_ {\mathrm { H } } 3.97 ; 3.48 ; 3.47 ; 3.15 \right ) \), 1 개의 oxygenated methylene signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } 62.3 ; \delta_ {\mathrm { H } } 3.94,1 \mathrm { H } \right . \), dd, \( \left .J=12.0,1.6 \mathrm { ~Hz } ; \delta_ {\mathrm { H } } 3.74,1 \mathrm { H } , \quad \mathrm { dd } , J=12.0,5.2 \mathrm { ~Hz } \right ) \) 의 chemical shift 및 anomer proton signal의 결합정수 \( (J=7.2 \mathrm { ~Hz } ) \) 로부터 당의 구조가 \( \beta \)-glucopyranose임을 확인하였다. 당의 결합위치를 확인하기 위하여 \( \mathrm { gHMBC } \) 를 측정하였다. 그 결과 anomer proton signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } 5.82, \mathrm { H } -1 \right ) \) 이 \( \mathrm { C } -7 \) 의 oxygenated olefin quaternary carbon signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . \) 166.4)과 cross peak를 보 여 glucose가 7번에 결합하고 있음을 알 수 있었다. 위의 data를 문헌값과 비교하여 화합물 4 를 tilianin으로 구조 동정 하였다.</p> <p>Apigenin (1)은 항산화 활성(Agar 등, 2015), 항염 활성 (Tavares 등, 2014), 미백 활성(Karim 등, 2014), 주름개선 활성 (Yu 등, 2015), 간세포보호 활성(Wang 등, 2016), 항암 활성 (Coombs 등, 2016)등이 보고되어 있다. Acacetin (2)은 항산화 활성(Yadav와 Yadava 2013), 항균 활성(Komape 등, 2014), 미백 활성, 주름개선 활성(Karim 등, 2014) 등이 보고되어 있다.Cosmetin (3)은 항산화 활성(Aprotosoaie 등, 2016), 항박테리아 활성(Karlickova 등, 2016), 미백 활성(Bouzaiene 등, 2016)등이 보고되어 있다. Tilianin (4)은 항산화 활성(Kang 등, 1999), 항암 활성(Mohamed 2010), 항알레르기 활성(Xie 등, 2012), 항염 활성(Semwal 과 Semwal 2012), 미백 활성(Thanigaimalai 등2010) 등이 보고되어 있다. 이와 같은 결과를 통해 위의 flavonoid 화합문들이 국화꽃 추출문의 주요한 활성 본체인 것을 확인 하였다. 또한 공통적으로 미백 활성, 항산화 활성, 항염 활성, 주름 개선 활성, 항균 활성, 항알레르기 활성 등의 기능성 화장품과 관련된 다양한 활성을 나타내는 것으로 보아 국화꽃의 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 확인하였다.</p>	[ "FAB-MS로 446의 분자량이 결정된 화합물 4는 IR 스펙트럼, 1H NMR을 통해 카보닐기, 수산기, 방항족 고리, pyridiyl 고리의 수소 방향성이 확인되었다. 당의 결합위치는 \\( \\mathrm { gHMBC } \\)를 측정해 확인하였는데, anomer proton signa이 \\( \\mathrm { C } -7 \\) 의 oxygenated olefin quaternary carbon signal과 cross peak를 보여 glucose가 7번에 결합하고 있음을 확인하였다. flavonoid 화합문들의 경우 국화꽃 추출문의 주요한 활성 본체임을 확인했다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-1c91-40de-8f85-4050912ba042_00	생명LA	국화(Chrysanthemum morifolium )꽃으로부터 Flavonoid의 분리 및 동정	<h1>서 론</h1> <p>국화는 국화과 (Compositae), 국화속(Chrysanthemum)에 속하는 다년생 초본식물로, 아시아에 주로 서식하며, 길가나 산, 들판에서 자란다. 주요한 용도는 관상용이나, 동아시아 문화권에서는 차나 방향제 등으로도 사용된다. 식물학적 특징으로는 \( 0.3 \sim 0.9 \mathrm { ~m } \) 까지 자라며, 꽃은 가을에 개화하고, 청색, 녹색, 오렌지색, 흰색 등 여러가지 색이 있다. 국화는 스탠다드형 국화, 스프레이형 국화, 화분국화 등으로 분류할 수 있는데, 현재 국내에서만도 \(700 \) 종 이상의 품종이 육종개발되어있다. 스탠다드형이 전체의 \( 80 \% \) 이상으로 생산량이 가장 많다(Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs \(2014 \) ). 국화꽃의 밝혀진 활성으로서는 항산화(Yuan 등, \(2015 \) ), 혈관형성 저해(Zheng 등, \(2015 \)), 항 \( \mathrm { HIV } \) 바이러스(Lee 등, \(2003 \) ), 항돌연변이(Miyazawa 와 Hisama \(2003 \) ), 세포독성(Xie 등, \(2009 \) ), 간독성 저해, 유전자독성 저해 (Lee 등, \(2011 \))활성 등이 보고되어 있다. 국화의 이러한 다양한 활성에 주목하며 국화품종 중 가장 생산량이 많은 스탠다드형 국화품종인 ‘백선'을 가지고 생리활성물질을 분리하고, 성분 분석을 통해 활용방안을 모색하고자 본 연구를 시작하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>실험 재료</h2> <p>본 실험에서 사용한 국화 '백선'(C. morifolium) 은 스탠다드형 국화로 \( 2015 \) 년 \( 9 \) 월에 양재꽃시장(서울, 대한민국)에서 흰색 꽃을 구입하였으며, 충청남도농업기술원 화훼연구소 (충청남도 예산군 오가면 역탑리) 박하승 박사가 동정하였다. 표본시료( KHU- \( \mathrm { NPCL } - 20150930) \) 는 경희대학교 천연물화학실에 보관되어 있다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>시약 및 기기는 이전 실혐과 동일하게 사용하였다( Lee 등, \(2016 \) ).</p> <h2>추출 및 분리</h2> <p>국화 ‘백선’의 건조한 꽃 \(485.0 \) \( g ^ {\circ } \) 를 \(80 \ % \) MeOH 수용액(50 L)으로 24시간씩 3번 실온에서 추출하였다. 얻어진 여액을 감압농축하여 MeOH 추출물(246.4 g)을 얻었다. 얻어진 \( \mathrm { MeOH } \) 추출물은 물( \(1 \) \( \mathrm { L } \))과 \( \mathrm { ethyl \ acetate } \) \( \mathrm { (EtOAc, 1 L×3) } \)로 분배 추출하였고, 다시 물층을 \(n \) \( \mathrm { -butyl \ alcohol } \) \( \mathrm { (n-BuOH, 800 mL×3) } \)로 분배 추출하였다. 각층을 감압농축하여 \( \mathrm { EtOAc } \) 분획 \( \mathrm { (CBE, 8.5 g) } \, \(n \) \( \mathrm { -BuOH } \) 분획 \( \mathrm { (CBB, 27.7 g) } \) 및 물 분획 \( \mathrm { (CBW, 188 g) } \)을 얻었다. \( \mathrm { EtOAc } \) 분획 \( \mathrm { (CBE, 8.5 g) } \)에 대하여 \( \mathrm { silica \ gel \ (SiO_2) } \) \( \mathrm { columnchromatography } \) \( \mathrm { (c.c., φ4.4×15.0 cm, CHCl_3-MeOH = 10:1→5:1 } \),각 \( \mathrm { 2.0 L } \))를 실시하여 \(11 \)개의 분획 \( \mathrm { (CBE-1~CBE-11) } \)을 얻었다.그 중에서 \( \mathrm { CBE-2 } \) 분획 \( \mathrm { [423.6 mg, elution \ volume/total \ volume(Ve/Vt) \ 0.032-086 } \)]에 대하여 \( \mathrm { SiO_2 c.c. (φ3.0×16.0 cm, CHCl3-MeOH-water=50:3:1→24:3:1, } \) 각 \( \mathrm { 470 mL } \))를 실시하여 화합물 \( \mathrm { 2(CBE-2-6, 6.9 mg, Ve/Vt 0.207, SiO_2 \ TLC \ R_f 0.61, CHCl 3-MeOH-water=50:3:1) } \)를 분리하였다. \( \mathrm { CBE-9 } \) 분획 \( \mathrm { (284.5 mg, Ve/Vt \ 0.535-649) } \)을 \( \mathrm { SiO_2 \ c.c. \ (φ3.0×15.0 cm, CHCl3-MeOH-water=30:3:1→27:3:1, } \) 각 \( \mathrm { 3.5 L } \))를 실시하여 총 \(13 \)개의 분획 \( \mathrm { (CBE-9-1~CBE-9-13) } \)을 얻었다. 그 중 \( \mathrm { CBE-9-9 } \) 분획 \( \mathrm { (61.9 mg, \ Ve/Vt0.533-632) } \)에 대하여 \( \mathrm { octadecyl \ silica \ gel \ (ODS) \ c.c. } \) \( \mathrm { ( φ2.0×5.0cm, MeOH-water=1:2, \ 1.3 L) } \) 를 실시하여 화합물 \( \mathrm { 3 (CBE-9-9-5, 7.4 mg, \ Ve/Vt \ 0.322-410, \ SiO_2 \ TLC \ R_f 0.49 \ CHCl_2-MeOH-water=9:3:1) } \)을 분리하였다. \(n \) \( \mathrm { -BuOH } \) 분획 \( \mathrm { (CBB, 27.7g) } \)에 대하여 \( \mathrm { SiO_2 \ c.c. \ (φ7.0×10.0 cm, CHCl_3-MeOH=7:1→5:1→3:1 \ CHCl_3-MeOH-water=12:3:1→10:3:1→7:3:1→65:35:10, } \) 각 \( \mathrm { 1 L } \))를 실시하여 \(13 \)개의 분획 \( \mathrm { (CBB-1~CBB-13) } \)을 얻었다. 그 중에서 \( \mathrm { CBB-7 } \) 분획 \( \mathrm { (797.6 mg, \ Ve/Vt \ 0.255-318) } \)에 대하여 \( \mathrm { SiO_2 \ c.c. \ ( φ4.5×15.0 cm, \ CHCl_3-MeOH=4:1, \ 2.1 L) } \)를 실시하여 화합물 \( \mathrm { 4 (CBB-7-4, 28.3 mg, Ve/Vt \ 0.192-205, \ SiO_2 \ TLC \ R_f \ 0.27 \ CHCl_3-MeOH=3:1) } \)를 분리하였다. \( \mathrm { CBB-10 } \) 분획 \( \mathrm { (1.02 g,Ve/Vt \ 0.563-899) } \)에 대하여 \( \mathrm { SiO_2 \ c.c. (φ4.0×16.0 cm, \ CHCl_3-MeOH-water=10:3:1→8:3:1→7:3:1, } \) 각 \( \mathrm { 2 L } \))를 실시하여 총 \(9 \)개의 분획 \( \mathrm { (CBB-10-1~CBB-10-9) } \)을 얻었으며, 화합물 \( \mathrm { 3 (CBB-10-5, 253.9 mg, \ Ve/Vt \ 0.182-482, \ SiO_2 \ TLC \ R_f \ 0.60 \ CHCl_3-MeOH-water=65:35:10) } \)을 분리하였다. \( \mathrm { CBB-10-4 } \) 분획 \( \mathrm { (19.5 mg,Ve/Vt \ 0.150-179) } \)에 대하여 \( \mathrm { SiO_2 \ c.c. \ (φ1.5×16.0 cm, CHCl_3-MeOH-water=50:3:1, } \) \( \mathrm { 1.6 L) } \)를 실시하여 화합물 \( \mathrm { 1 (CBB-10-4-1,13.0 mg, Ve/Vt \ 0.007-296, SiO_2 \ TLC \ R_f \ 0.42 \ CHCl_3-MeOH-water=18:3:1) } \)을 분리하였다. \( \mathrm { CBB-10-6 } \) 분획 \( \mathrm { (405.2 mg, \ Ve/Vt \ 0.146-216) } \)에 대하여 \( \mathrm { SiO_2 \ c.c. \ (φ2.5×16.0 cm, CHCl_3-MeOH-water=18:3:1→12:3:1, } \) 각 \( \mathrm { 2.5 L } \))를 실시하여 화합물 \( \mathrm { 4 (CBB-10-6-4, 13.8 mg, Ve/Vt \ 0.139-372, SiO_2 \ TLC \ R_f \ 0.52 \ CHCl_3-MeOH-water=9:3:1) } \)를 분리하였다.</p>	[ "국화는 국화과, 국화속에 속하는 다년생 초본식물로, 아시아 길가나 산, 들판에 주로 서식하며, 국화는 스탠다드형 국화, 스프레이형 국화, 화분국화 등으로 분류할 수 있는데, 현재 국내에서만도 700종 이상의 품종이 육종개발되어있다. 국화꽃의 밝혀진 활성으로서는 항산화, 혈관형성 저해, 항 HIV 바이러스, 항돌연변이, 세포독성, 간독성 저해, 유전자독성 저해 활성 등이 보고되어 있으며, 국화의 이러한 다양한 활성에 주목하며 국화품종 중 가장 생산량이 많은 스탠다드형 국화품종인 ‘백선'을 가지고 생리활성물질을 분리하고, 성분 분석을 통해 활용방안을 모색하고자 한다. 추출 및 분리 방법으론, 국화 ‘백선’의 건조한 꽃 \\(485.0 g ^ {\\circ } \\) 를 \\(80 \\ % \\) MeOH 수용액(50 L)으로 24시간씩 3번 실온에서 추출하여 얻어진 여액을 감압농축하여 MeOH 추출물(246.4 g)을 얻었다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-1f85-4ac6-8393-d2f1358114af_04	생명LA	대장균에서 naringenin으로부터 생리활성 isokaemferide의 생합성	<p>미생물을 이용한 생리활성물질의 생산은 많은 연구자들의 관심을 받고 있다. 현재 간단한 탄소원인 포도당으로부터 플라보노이드를 생합성 위한 많은 연구들이 진행되고 있다. 하지만, 단순당으로부터 생리활성물질들을 생합성 하기 위해서는 복잡한 생합성 경로를 도입해야 하고, 이차대사산물 합성에 공급되는 cofactor와 같은 물질들을 미생물로부터 공급을 받아야 한다. 다른 말로 미생물 자체의 생합성과 생리활성물질생산 경로에 동시에 사용되기 때문에 각 단계의 cofactor를 원활하게 공급할 수 없는 문제점을 가지고 있어 생합성양의 증가에 많은 영항을 미친다. 이러한 단점을 극복하기 위하여 대사공학법 등이 도입되어 다양한 물질을 전합성 하는 연구가 진행되고 있다. 하지만, 단순당으로부터 전합성의 경우 복잡한 생합성경로 때문에 생리활성물질의 생산성을 증대시키는 데는 한계점을 보이고 있다. 이러한 단점을 극복할 수 있는 방법으로 값이 싼 물질을 기질로 사용하여 한 두 가지 효소를 미생물에 도입하여 생리활성물질을 생산 생물전환이다. 간 보호, 항균, 항증식성, 항염 등의 생리활성을 보이는 isokaempferide를 비교적 값이 싼 물질인 naringenin을 이용하여 생물전환을 실시하였다. 이에 부가적으로 메칠 donor인 SAM의 생합성 증대를 위한 대사조절과 배양방법을 최적화를 시도하였다. 그 결과 배양 후 24시간에 약 \( 87 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)의 isokaempferide를 생산할 수 있었으며 이것은 이전의 isokaempferide 생산 연구 \( (22.6 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \)에 비해 약 3.85배 증가된 생산성을 보였다. 향 후 연구에서 생산성을 반응에 들어가는 다른 \( \alpha \)-ketoglutaric acid와 같은 cofactor와 생물반응기를 이용한 생산성 증가에 대한 연구가 수행되어야 할 것이지만, 이상의 결과로 보아 본 연구에서 최적화한 isokaemperide 생산 방법은 기존의 식물에서의 추출방법을 보완해 줄 수 있을 것으로 보인다.</p> <h1>초 록</h1> <p>Flavonoid인 isokaempferide는 간 보호, 항균, 항증식성, 항염 등 다양한 생리활성을 가지는 것을 보고 되고 있으며 Amburana cearensis와 Cirsium rivulare (Jacq.)과 같은 식물에서 추출하여 사용한다. 생물전환은 비교적 값이 싼 물질로부터 고부가가치 물질을 얻기 위한 방법으로 유용물질의 식물추출법을 대체할 수 있는 방법이다. Naringenin으로부터 isokaempferide를 생합성 하기 위해 대장균에 포플러에서 분리한 PFLS와 벼에서 분리한 ROMT-9 유전자를 도입하였다. 이 균주를 이용하여 naringenin으로부터 isokaempferide의 생합성 수율 \( (9.8 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \)은 낮았다. Isokaempferide의 생합성 수율을 높이기 위해 S-adenosyl-methionine (SAM) 생합성 경로의 transcriptional regulator인 MetJ를 제거함으로써 methyl donor로 사용되는 SAM을 증가시켰다. SAM생합성 대사를 조절한 대장균을 이용하여 생불전환 균주의 최적 세포밀도 및 최적의 기질공급 농도를 결정하였다. 최적화된 조건을 이용하여 isokaempferide의 생합성은 \( 87 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)까지 증가하였다.</p>	[ "미생물을 이용한 생리활성물질 생산에 대한 관심이 높아지고 있는 가운데, 포도당과 같은 단순한 탄소원을 통한 플라보노이드의 생합성 연구가 이루어지고 있다. 복잡한 생합성 경로와 미생물에서의 cofactor 공급이 필요한 점이 도전과제로 남아있다. 이를 극복하기 위해 대사공학법을 도입하여 다양한 물질의 합성 연구가 진행 중이다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-1f85-4ac6-8393-d2f1358114af_01	생명LA	대장균에서 naringenin으로부터 생리활성 isokaemferide의 생합성	<p>본 연구에서 Poplar flavonol synthase (PeFLS)와 Rice O-mthyltransferae-9 (ROMT-9)를 이용하여 naringenin으로부터 isokaempferide를 생합성을 시도하였다. 또한 메칠전이효소의 donor로 사용되는 S-adenosyl methionine (SAM)의 생합성 증가를 시도하였고, isokaempferide생합성 최적화를 실시하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <p>PeFLS의 발현벡터제작은 이전에 클로닝한 플라스미드를 주형으로 이용하였다. PCR은 Taq polymerase를 활성화 시키기 위하여 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5분간 배양한 후 \( 94 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, \( 60 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, \( 72 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 1분, 총 35회 반복조건하에서 Hotstart Taq polymerase (Qiagen, Hilden, Germany)을 이용하여 실시하였다. Forward primer로 AT \( \underline { GAATTC } \)GATGGAGTTTGATAGAGTTCAA (밑줄 EcoR Ⅰ)와 reverse primer로 CAT \( \underline { GCGGCCGC } \)CTACTGGGGGAGACGATTG (밑줄 Not Ⅰ)을 실험에 사용하였다. PCR산물은 아가로스겔상에서 전기영동 한 후 Gel DNA Purification Kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하여 EcoR Ⅰ/NotⅠ 제한효소를 처리한 후 pCDFDuet의 동일한 제한효소자리에 클로닝 하였다. ROMT-9은 이전의 연구에서 구축된 플라스미드를 본 연구에 사용하였다.</p> <p>대장균 BL21 (De3)에서의 MetJ의 결실은 quick and easy conditional knockout kit (Gene Bridges, Heidelberg, Germany)를 사용하였다. MetJ 결실은 FRT-PGK-gb2-neo-FRT DNA를 template로 forward primer로 \( 5 ^ {\prime } \)-CGTAGCGCATCAGGCGATTCCACTCCGCGCCGCTCTTTTTTGCTTTAGTAAATTAACCCTCACTAAAGGGCG- \( 3 ^ {\prime } \)와 reverse primer로 \( 5 ^ {\prime } \)-TTCTTTGCGTATAGATTGAGCAAATCCCAAATAGCCGTTAAAATTATATGTAATACGACTCACTATAGGGCTC- \( 3 ^ {\prime } \)를 사용하였다. 돌연변이체의 확인은 forward primer \( 5 ^ {\prime } \)-GGTCGCAGACAACGTGCTCG- \( 3 ^ {\prime } \)와 reverse primer \( 5 ^ {\prime } \)-ACGCACTGCGATGGTGGCCT- \( 3 ^ {\prime } \)를 가지고 PCR로 확인하였다.</p> <h2>생물전환</h2> <p>PeFLS와 ROMT-9를 담고 있는 단일 콜로니를 ampicillin ( \( 50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \)과 spectinomycin \( (50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \)이 공급된 LB배지에 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 밤새도록 배양하였다. 다음날 아침 동일한 항생제가 첨가된 \( 25 \mathrm { ~mL } \)LB 배지를 담고 있는 \( 250 \mathrm { ~mL } \) 플라스크에 배양액 \( 250 \mu \mathrm { L } \)를 접종하여 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 배양하였다. 세포밀도가 OD \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 1.0에 도달하였을 때 IPTG의 최종농도가 \( 1 \mathrm { ~mM } \)이 되게 첨가하고 배양플라스크를 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 이동하여 20시간 동안 재조합단백질을 유도하였다. 배양이 끝난 후 원심분리기를 이용하여 세포를 회수한 후 \( 10 \mathrm { ~mL } \) Andrew's Magic Media (AMM)배지로 2회 세척하고 동일 배지에 세포밀도가 OD \( 600 \mathrm { ~nm } \)에서 3.0이 되게 현탁 하였다. 배양배지에 ITPG \( 1 \mathrm { ~mM } \), ampicillin \( 50 \mu \mathrm { g } \), spectinomycin \( 50 \mu \mathrm { g } \), naringenin \( 300 \mu \mathrm { M } \)의 최종농도가 되게 첨가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 생물전환을 실시하였다. 배양 12, 24시간 후 \( 500 \mu \mathrm { L } \)의 샘플을 회수하고 거기에 동량의 에칠아세테이트를 첨가하여 2회 반복하여 반응산물을 추출하였다. 반응산물은 진공건조기를 위하여 완전히 건조하여 DMSO \( 80 \mu \mathrm { L } \)에 다시 녹여 HPLC 분석에 이용하였다.</p>	[ "PeFLS와 ROMT-9를 이용하여 naringenin으로부터 isokaempferide를 생합성하고 S-adenosyl methionine (SAM)의 생합성 증가를 시도하여 isokaempferide 생합성 최적화를 실시하였으며 PeFLS의 발현벡터는 이전에 클로닝한 플라스미드를 주형으로 PCR을 통해 제작하였고, ROMT-9의 발현벡터는 pET-21a(+)를 이용하여 제작하였다.PeFLS와 ROMT-9를 담고 있는 단일 콜로니를 LB배지에 접종하여 \\( 37 ^ {\\circ } \\mathrm { C } \\)에서 밤새도록 배양하였으며 배양 12, 24시간 후에 샘플을 회수하고 거기에 동량의 에칠아세테이트를 2번 반복 첨가하여 반응산물을 추출하였다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-1f85-4ac6-8393-d2f1358114af_00	생명LA	대장균에서 naringenin으로부터 생리활성 isokaemferide의 생합성	<h1>서 론</h1> <p>식물이 생합성 하는 알칼로이드, 테르페노이드, 폴리페놀 등과 같은 이차대사산물은 기능성식품, 화장품, 의약품 등을 개발하기 위한 중요한 소재이다. 특히 폴리페놀에 속하는 플라보노이드는 가장 잘 알려진 이차대사산물중의 하나로서 항산화, 항암, 항노화, 항균, 항염 등과 사람의 건강과 관련된 다양한 생리적 기능뿐만 아니라 박테리아, 곰팡이, 바이러스, 곤충 등에 의해 야기되는 식물성 병에 대한 방어물질로 작용하는 것으로 알려져 있다. 플라보노이드의 다양한 의학적 유용성에도 불구하고 대부분의 플라보노이드는 식물로부터 추출하여 사용되기 때문에 유용한 플라보노이드를 안정적이고 일정하게 공급하는 것이 어렵다. 화학합성법으로 플라보노이드를 생합성 할 수 있지만, 플라보노이드 합성반응에 독성물질이 필요하거나 때로는 아주 극단적인 반응조건을 필요로 하는 경우가 있다. 따라서 이러한 어려움을 극복하고 다양한 식 \( \cdot \)의약 소재로 사용하기 위해 플라보노이드를 안정적으로 공급하기 위한 방법으로 식물세포배양법, hairy root배양법, 효모배양법, 미생물 배양법 등을 이용한 생산법 개발들이 시도되고 있다. 이들 중 미생물을 이용한 플라보노이드 생산시스템은 다른 생산 공정법에 비해 배양이 쉅고, 형질전환이 가능하며, 생합성에 필요한 각종 조효소들의 생합성경로 대사조절이 가능하기 때문에 최근들어 플라보노이드 생산 공정시스템을 개발하려는 연구가 다양하게 시도되고 있다.</p> <p>플라보노이드는 식물에서 페닐프로파노이드 생합성경로를 통해서 만들어지는 플라보노이드는 현재 약 9,000종 이상이 다양한 식물들에서 발견되고 있다. 식물에서 플라보노이드 생합성은 phenylalanine ammonia lyase (PAL)에 의해 페닐알라닌을 cinnamic acid로 전환하는 것으로부터 시작한다. Cinnamic acid는 cinnamic acid 4-hydroxylase에 의해 p-coumaric acid로 전환되고 순차적으로 4-Coumarate-CoA ligase, Chalcone synthase, chalcone isomerase에 의해 naringenin이 생합성되고 이는 다양한 플라보노이드를 생합성의 전구물질로 사용된다. 플라보노이드는 일반적으로 B링과 C링의 연결위치, hydroxylation, oxidation, saturation의 정도에 따라 플라바논, 플라보놀, 플라본, 이소플라본, 플라반-3-ol, 안토시아닌 등의 6그룹으로 나누어진다. 이들 중 플라보놀은 폐암, 결장암, 유방암, 위암, 식도암, 류마티스관절염, 당뇨병, 천식, 백내장 등의 다양한 질병에 효과를 보이는 것으로 보고되고 있다. 플라보놀은 안토시아닌, 프로안토시아닌과 생합성 경로를 공유한다. 일반적으로 식물에서 flavonol의 합성은 naringenin을 시발물질로 flavanone 3-hydroxylase (F3H)에 의해 dihydroflavonol로 촉매 되고 이는 다시 flavonol synthase (FLS)에 의해 flavonol (kaempferol)이 생합성 된다(Fig. 1). 하지만, 최근의 연구에 의하면 이러한 naringenin으로부터 kaempferol을 생합성 할 수 있는 새로운 type의 FLS유전자가 보고되었다.</p> <p>Isokaempferide는 주로 Amburana cearensis와 Cirsium rivulare(Jacq.) 로부터 추출되는 3-O-methylated kaempferol이다. Isokaempferide (5,7,4'-trihydroxy-3-methoxyflavone)의 in vitro 연구에서 간 보호, 항균, 항증식성, 항염 등의 효과를 가지는 것을 보였으며 기니 피그 적출기관(guinea pig isolated trachea)을 대상으로 한 실험에서 isokaempferide는 근육이완효과를 보였다. 이와 같이 다양한 생리활성에도 불구하고 isokaempferide는 식물에서 추출되어 사용되기 때문에 이물질을 안정적으로 공급하기 위해서는 공간적 계절적으로 많은 제약을 받는다. 따라서 isokaempferide의 공급뿐만 아니라 다른 생리활성들을 탐색하기 위해서 이 물질을 안정적으로 공급할 수 있는 대체 생산법의 개발이 필요하다.</p>	[ "식물의 이차대사산물 중 하나인 플라보노이드는 항산화, 항암, 항노화, 항균, 항염 등의 건강에 이로운 효능과 식물성 질병 방어물질로서의 작용을 하는 중요한 소재이다. 플라보노이드의 생산에 있어 미생물을 이용한 시스템은 배양의 용이성, 형질전환 가능성, 대사조절이 가능한 점 등으로 다른 방법에 비해 우수한 점이 많으며, 이에 따라 플라보노이드 생산 공정시스템 개발을 위한 다양한 연구가 진행되고 있다. 그러나 플라보노이드를 화학합성하는 방법은 독성물질이 필요하거나 극단적인 반응조건이 필요한 경우가 있어 문제점이 있다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-1f85-4ac6-8393-d2f1358114af_03	생명LA	대장균에서 naringenin으로부터 생리활성 isokaemferide의 생합성	<h2>Isokaempferide 생합성을 증가를 위한 대장균 engineering</h2> <p>Isokaempferide는 naringenin으로부터 생합성이 가능하였지만, 생산량은 높지 않았다. 생물전환 시간을 증가하면 제공한 기질이 전부 kaempferol로 생물전환이 되어도 isokaempferide로의 생물전환은 전부 일어나지 않았다. 이러한 결과는 이전의 연구에서도 보고되었다. 이는 대장균 생체내에서 공급되는 메칠 도너인 SAM의 공급이 isokaempferide의 생합싱에 영향을 미칠 수 있다는 것을 암시한다. 이전에 연구에 의하면 대장균내 SAM synthase의 과발현은 SAM의 생합성을 크게 증가시키지 못하는 것으로 나타났다. 이는 대장균에서 SAM의 생합성이 증가하면 리간드 반응 전사조절인자인 MetJ에 의해서 SAM생합성과 관련된 9개의 프로모터로부터 적어도 12개의 유전자를 억제 하는 것으로 알려져 있다. Isokaempferide의 생합성에 Met의 영향을 알아보기 위하여 quick and easy conditional knockout kit (Gene Bridges, Heidelberg, Germany)를 이용하여 MetJ를 제거하였으며, 이 균주는 B-MetJ로 명명하였다. B-MetJ에 PFLS와 ROMT-9을 도입하였으며, 이 균주를 B-MetJ-PR로 명명하였다. B-MetJ-PR과 BL-PR균주의 isokaempfride의 생합성능력을 알아보았다. BL-PR균주는 \( 9.8 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)를 생산한 반면 B-MetJ-PR 균주는 \( 17.9 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)를 생산하여 약 1.83배 정도 증가된 생합성능력을 보였다. 이러한 결과는 대장균내의 MetJ 결실이 isokaempferide의 생합성에 많은 영항을 미쳤다는 것을 알 수 있다.</p> <p>B-MetJ-PR균주를 이용하여 최적의 생물전환조건을 탐색하기 위하여 생물전환시의 세포의 밀도 및 기질의 농도를 최적화 하였다. 먼저 세포 밀도의 최적화를 알아보기 위하여 OD \( _ { 600 \mathrm { ~nm } } \)에서 세포밀도를 1.0, 2.0, 3.0, 5.0, 8.0으로 조절하였다. Isokaempferide의 생산은 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 배양 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 테스트한 세포밀도들 중에서 OD \( _ { 600 } =5.0 \) (약 \( 49.8 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) )에서 가장 높은 생산을 보였으며 다음으로 8.0으로 약 \( 27.9 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)를 이었다. 그에 반하여 세포의 밀도가 낮아지면 생물전환효율이 현저하게 감소하는 경향을 보여다(Fig. 3). 다음으로 기질 공급농도의 최적화를 알아보기 위하여 기질로 사용된 naringenin의 최종 공급농도를 \( 100 \mu \mathrm { M } (27.2 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \), \( 200 \mu \mathrm { M } (54.4 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \), \( 300 \mu \mathrm { M } (81.6 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \), \( 500 \mu \mathrm { M } (136 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \), \( 700 \mu \mathrm { M } (81.6 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \), \( 1000 \mu \mathrm { M } (272 \mathrm { mg } / \mathrm { L } ) \)로 생물전환 배지에 첨가하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 12시간 배양 후 isokaempferide의 생산성을 분석하였다. 테스트한 농도 중에서 \( 300 \mu \mathrm { M } \)에서 isokaempferide의 최적의 생산성을 보인데 반하여 그 이상의 기질 공급농도에서는 생합성능력은 현저히 저하되는 경항을 보였다(Fig. 4). 최적화된 조건을 이용하여 naringenin으로부터 isokaempferide의 생산을 \( 30 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 교반배양기에서 48시간 동안 모너터링 하였다. Isokaempferide배양 후 2시간부터 생합성이 관찰되는데 반하여 naringenin의 농도는 급격하게 감소하기 시작하여 배양 후 12시간에 아주 소량만 이 관찰되었다. 중간물질인 aromadendrin과 kaempferol은 배양초기에 증가하였다가 배양 후 24시간에 대부분이 isokaempferide로 전환되는 것을 보였다. 이 시점에 약 약 \( 87 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \)의 isokaempferide 생산성을 보였으며, 배양 후 48시간에 isokaempferide 생산성은 약간 감소하는 경항을 보였다(Fig. 5).</p>	[ "Naringenin에서 Isokaempferide의 생합성이 가능하였으나, 생산량은 높지 않았다. MetJ 결실을 가진 B-MetJ-PR 균주가 BL-PR 균주에 비해 약 1.83배 높은 Isokaempferide 생합성능력을 보였다. 최적의 생물전환 조건을 찾기 위해, 세포 밀도와 기질 농도를 조절하였고, 이 중 세포 밀도가 OD \\( _ { 600 } =5. 0 \\) (약 \\( 49. 8 \\mathrm { mg } / \\mathrm { L } \\))일 때 가장 높 은 생산을 보였다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-1f85-4ac6-8393-d2f1358114af_02	생명LA	대장균에서 naringenin으로부터 생리활성 isokaemferide의 생합성	<h2>HPLC분석</h2> <p>반응물은 photodiode array 검출기와 Polaris 5 C18-A column( \( 250 \mathrm { ~mm } \times 4.6 \mathrm { ~mm } \), Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)가 부착된 Varian high performance liquid chromatography (HPLC) 시스템(Agilent Technologies)을 이용하여 분석하였다. HPLC분석은 \( 0.1 \% \) formic acid가 첨가된 증류수( A buffer)와, \( 0.1 \% \) formic acid가 첨가된 acetonitrile (B buffer)를 사용하여 실시하였다. 분석프로그램은 0분에 \( 20 \% \) B버퍼, 8분에 \( 40 \% \) B버퍼, 12분에 \( 90 \% \) B버퍼, 15분에 \( 90 \% \) B버퍼, 15.1분에 \( 10 \) B버퍼, 20분에 \( 10 \% \) B버퍼의 조건을 사용하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>Naringenin으로부터 isokaempferide 생합성</h2> <p>Isokaempferide는 Amburana cearensis와 Cirsium rivulare (Jacq.)의 주요 구성물질로 간 보호, 항균, 항증식성, 항염 등의 생리 효과를 보이는 3-O-methylation된 kaempferol이다. Naringenin으로부터 isokempferide를 생합성 하기 위해서는 F3H, FLS, OMT (flavonoid O-methyl transferase) 등의 3유전자가 필요하다. 최근 연구결과에 의하면, 포플러에서 분리된 PFLS는 F3H와 FLS의 기능을 동시에 수행하는 것으로 보고되었다. 벼에서 분리한 ROMT-9은 flavone 및 flavonol \( 3 ^ {\prime } \)-O-methyltransferase이지만, flavonol의 경우 \( 3 ^ {\prime } \)의 hydroxyl group을 이용할 수 없을 때 3번 위치의 hydroxyl group을 methylation 시킨다. 따라서 대장균에서 naringenin을 기질로 isokaempferide를 생합성 하기 위해서 2개의 유전자, PFLS와 ROM-9을 이용하였다. 두 유전자, PFLS와 ROMT-9을 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환 하였고 결과 균주를 BL-PR로 명명하였다. BL-PR균주를 이용하여 naringenin으로부터 isokaempferide의 생합성능력을 테스트하기 위하여 \( 2 \mathrm { ~mL } \) LB배지를 이용하여 \( 30 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 20시간 동안 재조합 단백질을 유도한 후 AMM배지를 이용하여 생물전환을 실시하였다. 생물전환 12시간 후 배양액을 회수하여 에칠아세테이트로 추출하고 완전히 건조한 후 HPLC분석을 실시하였다. 그 결과 기질로 사용된 naringenin \( (12.7 \mathrm { ~min } ) \)을 제외하고 총 3개의 새로운 peak이 생성되었다(Fig. 2B). P1 \( ( 9.5 \mathrm { ~min } ) \)의 UV 흡광도는 기질로 사용된 나린제닌과 유사하였고 이는 전형적인 flavanone의 UV흡광도 패턴과 일치하였다. 따라서 이 물질은 kaempferol의 전구물질인 aromadendrin으로 추정되었다(Fig. 2D). P2 \( ( 13.8 \mathrm { ~min } ) \)는 전형적인 flavonol의 UV 흡광도를 가지고 있으며, 표준물질 kaempferol과 동일한 흡광도와 용출 시간대를 보였다(Fig. 2B). P3 \( ( 14.1 \mathrm { ~min } ) \)는 kaempferol의 흡광도에 비해서 band Ⅰ의 UV최고 흡광도가 \( 365 \mathrm { ~nm } \)에서 \( 350 \mathrm { ~nm } \)으로 이동한 결과를 보였다(Fig. 2D). 이것은 flavonol의 3번 위치의 구조 변화에 의한 전형적인 hypsochromic shift 현상이다. 따라서 P3는 isokaempferide로 추정되었다. P3의 구조를 명확하게 결정하기 위하여 반응물을 HPLC로 분리하여 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR 분석에 이용하였다. NMR 데이터의 분석 결과는 Aceton d6, \( 500 \mathrm { MHz } \) ; 3.87 ( \(3 \mathrm { H } \), s), 6.26 ( \(1 \mathrm { H } \), d, J \( = 2.1 \mathrm { ~Hz } ) \), 6.50 ( \( 1 \mathrm { H } \), J= \( 2.1 \mathrm { ~Hz } \) ), 7.02 ( \(2 \mathrm { H } \), d, J \( =9.0 \mathrm { ~Hz } \) ), 8.03 ( \( 2 \mathrm { H } \), d, J \( =9.0 \mathrm { ~Hz } \)), 12.80 ( \(1 \mathrm { H } \), s)와 같았다. 이러한 결과는 이전에 발표한 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \)-NMR 결과와 일치하였다. 이상의 결과를 종합해 보면 BL-PR 균주는 naringenin을 기질로 하여 isokaempferide 생합성이 가능하다는 알 수 있다.</p>	[ "HPLC분석을 통해 Varian high performance liquid chromatography(Agilent Technologies)과 photodiode array 검출기, Polaris 5 C18-A column을 사용하여 0.1% formic acid가 첨가된 A buffer와 B buffer를 사용하여 0분부터 15.1분까지 20%, 40%, 90% B buffer로 전이하여 분석하였다. 분석한 결과 BL-PR 균주는 naringenin을 기질로 하여 isokaempferide 생합성을 할 수 있다는 것을 알아냈다." ]
55e-0c9-a2832fb3-de0c-40c6-bca4-f574f573a1ed	생명LA	브로콜리(Brassica oleracea var. italica)의 온도 스트레스 평가를 위한 다중 센서 모니터링	<h2>저온 스트레스 하에서 Brassica oleracea var. italica의 반응</h2> <p>상대습도 \( 60 \%, 16 \)시간 광주기로 정상 생육조건과 마찬가지로 상대습도와 광주기를 유지하면서 주간/야간의 온도조건을 \( 15 / 10 \)\( { }^{\circ} \mathrm{C} \)로 하여 저온 스트레스를 받은 Brassica oleracea var. italica의 ECps와 sap flow rate는 대기 온도와 토양온도가 감소함에 따라 정상적인 생육 조건의 \( \mathrm{ECps} \)와 sap flow rate 보다 값이 급격하게 감소했다(Fig. 2). Repo 등은 저온 스트레스가 지속되는 동안 식물의 줄기에서 세포 외 및 세포 내 저항이 증가했다고 보고하였다. 저항은 전기전도도와 반비례하기 때문에 이는 저온 스트레스 하에서 전기전도도가 감소함을 의미한다. 또한, 저온 토양은 뿌리 성장, 영양소 및 수분의 흡수뿐만 아니라 광합성 및 기공 전도도를 감소시킨다. 가뭄 스트레스와 유사하게, 저온 스트레스를 받은 Populus tremuloides의 뿌리는 수분흡수를 억제하고 기공 전도도를 감소시켰다. 따라서 수분 및 이온의 수송에 관련이 있는 ECps와 sap flow rate가 저온스트레스 조건에서 감소하였음을 알 수 있다. ECps, sap flowrate, 대기 온도와 토양 온도를 제외한 상대습도, \( \mathrm{CO}_{2} \), 토양 수분, 토양 전기전도도는 정상적인 생육 조건 하에서의 상태와 큰 변화가 없었으며, 토양 수분 및 토양 전기전도도 값은 관수를 하였을 때 급격히 증가하였다(Fig. 2).</p> <p>저온 스트레스하에서 Brassica oleracea var. italica 잎의 엽록소 \( \mathrm{a} \) 및 \( \mathrm{b} \) 함량은 정상적인 생육 조건에서 자란 엽록소 함량보다 높게 나타났으며 유의한 차이가 있었다(Fig. 3A). 일반적으로 저온 조건에서는 엽록소 생합성이 감소하기 때문에 저온 스트레스에서는 식물 잎의 엽록소 함량이 감소한다. 그러나 본 연구에서는 저온 스트레스하에서 엽록소 함량이 증가하였다. Markhart et al. 에 따르면 Brassica oleracea var. italica은 저온에 저항성이 있기 때문에 저온조건에서 스트레스를 받지 않은 것으로 판단된다. 저온 스트레스 조건에서 Brassica oleracea var. italica의 프롤린 함량은 정상적인 생육 조건에서 자란 잎의 프롤린 함량과 비교하여 유의한 차이가 없었다(Fig. 3B). 일반적으로 식물이 생물학적 또는 비생물학적인 스트레스를 받으면 프롤린 함량이 증가할 수 있다. 프롤린의 축적은 식물이 저온 스트레스 상태에 견딜 수 있게 해주며 이는 스트레스 반응과 상관 관계가 있다. 저온 조건에서 프롤린은 저온 손상에 대한 반응으로 Hordeum distichum L., Malus sylvestris 및 Triticum aestivum L.의 잎에 축적되었다. 본 연구에서 저온 스트레스 조건에서 프롤린의 함량이 증가하지 않은 것은 엽록소 함량이 증가한 것과 마찬가지로 Brassica oleracea var. italica가 저온스트레스를 받지 않았다는 것을 보여준다. 저온 스트레스를 받은 Brassica oleracea var. italica의 건물중은 잎, 줄기, 뿌리 모두 유의한 차이가 없었다(Table 1). 따라서, 저온 스트레스하에서 엽록소와 프롤린 함량 및 건물중을 대조구와 비교해보면 Brassica oleracea var. italica는 저온에 스트레스를 받지 않은 것으로 판단된다.</p>	[ "본 논문에서는 저온 스트레스 하에서 Brassica oleracea var. italica의 반응에 대한 연구를 진행하였다. 상대습도 \\( 60 \\%, 16 \\)시간 광주기로 정상 생육조건과 마찬가지로 상대습도와 광주기를 유지하면서 주간/야간의 온도조건을 \\( 15 / 10 \\)\\( { }^{\\circ} \\mathrm{C} \\)로 설정하여 실험을 진행하였다. ECps, sap flowrate, 대기 온도와 토양 온도를 제외한 상대습도, \\( \\mathrm{CO}_{2} \\), 토양 수분, 토양 전기전도도는 정상적인 생육 조건 하에서의 상태와 큰 변화가 없었으며, 토양 수분 및 토양 전기전도도 값은 관수를 하였을 때 급격히 증가하는 것을 확인하였다. 프롤린의 축적은 식물이 저온 스트레스 상태에 견딜 수 있게 해주며 이는 스트레스 반응과 상관 관계를 확인하였다." ]
55e-0c9-ac1fae5f-7f93-4b0f-9702-63aa5bbcf9fd	생명LA	브로콜리(Brassica oleracea var. italica)의 온도 스트레스 평가를 위한 다중 센서 모니터링	<h2>고온 스트레스 하에서 Brassica oleracea var. italica의 반응</h2> <p>상대습도가 \( 60 \%, 16 \)시간 광주기로 \( 35 / 30{ }^{\circ} \mathrm{C} \) (주간/야간)에 노출시켜 고온 스트레스를 받은 Brassica oleracea var. italica의 ECps와 sap flow rate는 정상적인 생육 조건의 ECps와 sap flow rate 보다 온도를 변경하면서 값이 증가하였다(Fig. 4). Lekas 등은 전나무와 가문비 줄기의 전기전도도가 광합성 유효광량자속 밀도와 온도가 증가함에 따라 증가하였다고 보고하였다. 또한, 고온 스트레스를 받은 Carrizo citrange와 Cleopatra mandarin은 정상적인 생육조건보다 더 높은 기공 전도도와 증산율을 보였다. 따라서, 물 및 이온 수송의 증가와 관련이 있는 ECps가 고온 생육 조건에 의해 증가된 것으로 판단된다. ECps, sap flow rate, 대기 온도와 토양 온도를 제외한 상대습도, \( \mathrm{CO}_{2} \), 토양 수분, 토양 전기전도도는 정상적인 생육 조건 하에서의 값과 큰 변화가 없었다. 토양 수분 및 토양 전기전도도 값은 관수를 하였을 때 급격히 증가하였다(Fig. 4).</p> <p>고온 스트레스를 받은 잎의 엽록소 \( \mathrm{a} \), 엽록소 \( \mathrm{b} \)의 함량은 정상적인 생육조건과 비교하여 유의한 차이가 없었다(Fig. 3A). 고온 스트레스를 받은 Arabidopsis thaliana L.에서는 엽록소 분해의 첫 단계를 촉매하는 엽록소 분해 효소가 증가하여 잎의 엽록소를 클로로필리드(chlorophyllide)와 피톨(phytol)로 가수분해하여 엽록소의 함량이 감소하였다. 그러나 본 연구에서는 엽록소 함량에 유의한 차이가 없어 고온으로 인한 스트레스가 엽록소 함량에 반영이 안된 것으로 보이며 이는 고온에 노출시킨 시간이 엽록소 함량에 영향을 미칠 만큼 충분히 길지 않았기 때문인 것으로 판단된다. 고온에 노출된 Brassica oleracea var. italica 잎과 줄기의 건조 중량도 대조구와 유의한 차이가 없어 생육량에 차이를 미칠 만큼 스트레스 처리가 길지 않았던 것으로 판단된다(Table 1).</p> <p>고온 스트레스를 받은 잎의 프롤린 함량은 정상적인 조건에서 생육했을 때 보다 증가하였다(Fig. 3B). 프롤린은 스트레스 환경에서 삼투조절 외에도 산화 환원 균형 유지 및 라디칼 소거, 분자 샤페론(molecular chaperone) 역할을 하는 단백질 고유구조의 유지 등 다양한 효소의 활성을 강화하고 세포막 손상을 줄이는 데 기여하는 등 많은 다른 보호 효과를 나타낸다. 따라서, 프롤린의 축적은 고온으로 인한 증산 속도의 증가 및 토양 가뭄으로 인한 수분 손실과 관련이 있다. 본 연구에서는 고온 스트레스 하에서 Brassica oleracea var. italica의 프롤린 함량이 현저히 증가하여 고온으로 인한 스트레스를 받았다고 판단된다.</p> <p>본 연구에서는 온도 변화에 따른 식물의 반응을 모니터링하기 위한 방법으로 ECps와 sap flow rate를 측정하였으며 외부 온도변화에 따라 식물의 양수분 이동이 즉각적으로 반응하여 ECps의 값이 변화되는 것을 확인하였다. 그러나 sap flow rate의 경우 저온과 고온 조건에서 온도 변화와 같은 패턴으로 값이 변화하여 광합성과 증산에 따른 식물의 수액 이동을 제대로 반영하지 못한 것으로 판단된다. ECps가 식물의 스트레스를 잘반영하는지 평가하기 위해 엽록소와 프롤린 함량, 건물중을 대조구와 비교하였으며 건물중의 경우 처리 시간이 짧아 유의한 차이가 나타나지 않았으나 프롤린 함량의 변화로 식물의 스트레스 여부를 확인할 수 있었다. 그러나 프롤린 함량은 파괴적인 방법으로 분석이 가능하며, 분석 시간이 오래 걸리고 측정법이 복잡하다. 그러나 식물 양수분 이동의 활성도를 보여주는 ECps는 비파괴적으로 식물의 상태를 지속적으로 모니터링 할 수 있어 환경 조건의 변화에 따른 식물의 이상 반응을 빠르게 판단하고 스트레스 환경을 즉각적으로 개선하는데 적용할 수 있다고 판단된다.</p>	[ "고온 스트레스 하에서의 Brassica oleracea var. italica의 반응을 살펴보면 상대습도, \\( \\mathrm{CO}_{2} \\), 토양 수분, 토양 전기전도도는 정상적 생육환경과 비교하여 유의미한 변화가 보이지 않았다. 그러나 토양전기도도 값은 관수를 한 경우 크게 증가했다. 고온 스트레스를 받은 잎의 엽록소 \\(\\mathrm{a}\\)와 엽록소 \\(\\mathrm{b}\\)는 모두 정상적 생육조건과 비교하여 큰 차이가 없었지만 프롤린 함량은 크게 증가햇다. 본 연구에서는 외부 온도 변화에 따라 식물의 양수분이 즉시 이동하여 ECps 값이 변화되었다." ]
55e-0c9-67eedb06-65b2-4f59-bf6d-b7263ced6fa8	생명LA	브로콜리(Brassica oleracea var. italica)의 온도 스트레스 평가를 위한 다중 센서 모니터링	<h2>잎의 엽록소 함량 분석</h2> <p>스트레스에 의한 엽록소 함량 변화를 평가하기 위해, 대조구, 저온 및 고온 처리 후에 Brassica oleracea var. italica 잎을 무작위로 채취하였다. 채취한 잎을 증류수로 세척한 다음 작은조각으로 분쇄하였다. 신선한 잎(FW) \( 0.5 \mathrm{~g} \) 을 \( 50 \mathrm{~mL} \) 코니컬 튜브에 넣고 \( 25 \mathrm{~mL} \)의 \( 80 \% \) 아세톤을 첨가하였다. 코니컬 튜브를 흔들어 24시간 동안 암조건에 두었다. \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 실린지 필터로 여과한 후, UV/Vis 분광 광도계(Orion AquaMate 7000, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 \( 80 \% \) 아세톤을 blank로 하여 645 및 \( 665 \mathrm{~nm} \)에서의 흡광도를 측정하였다. 식물 잎의 엽록소 a 및 b 함량은 Maclachlan 및 Zalik의 방정식에 따라 계산하였다.</p> <p>\( C_{a}=\frac{\left(12.3 D_{663}-0.86 D_{645}\right) \times V}{d \times 1000 \times W} \)<caption>(2)</caption></p> <p>\( C_{b}=\frac{\left(19.3 D_{645}-3.60 D_{663}\right) \times V}{d \times 1000 \times W} \)<caption>(3</caption></p> <p>\( \mathrm{C}_{\mathrm{a}} \)는 엽록소 \( \mathrm{a} \) 함량 \( (\mathrm{mg} / \mathrm{g} \mathrm{FW}), \mathrm{C}_{\mathrm{b}} \) 는 엽록소 \( \mathrm{b} \) 함량 \( (\mathrm{mg} / \mathrm{g} \)\( \mathrm{FW}), \mathrm{D} \)는 표시된 파장에서의 광밀도, \( \mathrm{V} \)는 최종 용액 부피 \( (\mathrm{mL}) \), \( \mathrm{W} \)는 신선한 잎의 무게 \( (\mathrm{g}), \mathrm{d} \) 는 빛의 경로 \( (\mathrm{cm}) \)이다.</p> <h2>잎의 프롤린 함량 분석 및 식물 건조 중량 측정</h2> <p>엽록소 분석과 동일한 방식으로 Brassica oleracea var. italica 잎을 채취하였다. 잎을 증류수로 세척하고 작은 조각으로 분쇄했다. 프롤린 함량은 Bates et al. 이 제안한 acid-ninhydrin reagent ( \( 2.5 \mathrm{~g} \) ninhydrin, \( 60 \mathrm{~mL} \) glacial acetic acid 및 \( 40 \mathrm{~mL} \)\( 6 \mathrm{M} \) phosphoric acid)으로 추출한 후 비색법을 사용하여 분석하였다. \( 50 \mathrm{~mL} \) 코니컬 튜브에 \( 10 \mathrm{~mL} 3 \% \) sulfosalicylic acid와\( 0.5 \mathrm{~g} \) 의 신선한 잎 \( (\mathrm{FW}) \)을 혼합하고 초음파분산기에서 30분 동안 반응시켰다. 추출된 용액을 \( 25^{\circ} \mathrm{C} \)에서 10분 동안 \( 4000 \mathrm{rpm} \)으로 원심 분리하고 \( 0.45 \mu \mathrm{m} \) 실린지 필터로 여과하였다. 여과액 \( 2 \mathrm{~mL} \)를 \( 2 \mathrm{~mL} \)의 acid-ninhydrin reagent 및 \( 2 \mathrm{~mL} \)의 glacial acetic acid와 혼합하고 \( 100^{\circ} \mathrm{C} \)에서 1시간 동안 가열하였다. 얼음물에서 샘플을 냉각시킨 후, \( 4 \mathrm{~mL} \)의 톨루엔을 용액에 첨가하고 20초 동안 교반하였다. 발색단을 함유하는 톨루엔을 수성상으로부터 분리하고 UV/Vis 분광 광도계를 사용하여 톨루엔을 blank로 하여 \( 520 \mathrm{~nm} \)에서 흡광도를 측정하였다. 프롤린 농도는 표준 곡선 \( (0-500 \mu \mathrm{g} / \mathrm{mL}) \)을 만든 후, 신선한 잎 중량을 기준으로 계산하였다.</p> <p>Brassica oleracea var. italica를 온도 스트레스 조건에 노출시키고 식물 반응과 환경 조건을 모니터링 한 후 잎, 줄기, 뿌리로 나누어 증류수로 세척한 다음 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 오븐에서 건조 후 중량을 측정하였다.</p>	[ "\\( C_{a}=\\frac{\\left(12.3 D_{663}-0.86 D_{645}\\right) \\times V}{d \\times 1000 \\times W} \\) \\( C_{b}=\\frac{\\left(19.3 D_{645}-3.60 D_{663}\\right) \\times V}{d \\times 1000 \\times W} \\)는 각각 엽록소 \\(\\mathrm{a}\\)와 엽록소 \\(\\mathrm{b}\\)의 함량을 말하며 \\(\\mathrm{D}\\)는 광밀도 \\(\\mathrm{V}\\)는 용액 부피 \\(\\mathrm{W}\\)는 잎의 무게 \\(\\mathrm{d}\\)는 빛의 경로이다. 또한 엽록소 분석과 같은 방식으로 Brassica oleracea var.italica 잎 잎을 채취하여 프롤린 함량을 분석했다." ]
55e-0c9-b228759c-8a7a-4899-92a1-222eb2a88519	생명LA	브로콜리(Brassica oleracea var. italica)의 온도 스트레스 평가를 위한 다중 센서 모니터링	<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>정상적인 생육 조건 하에서 Brassica oleracea var. italica의 반응</h2> <p>Brassica oleracea var. italica를 저온 밋 고온에 노출시키기 전에, 정상적인 생육 조건 하에서 식물 반응 ECps, sap flowrate), 기후 조건(온도, 상대습도, 광합성유효광량자속 밀도, \( \mathrm{CO}_{2} \) )및 토양 조건(토양온도, 토양 수분함량, 전기전도도)을 모니터링 하였다. 생장상의 설정 조건에 따라 낮에는 광합성유효광량자속밀도, 대기 온도 및 토양 온도가 증가하였으며 상대습도는 밤과 낮 모두 \( 60 \% \)로 설정하였으나 밤에 약간 증가하는 경향을 보였으며 \( \mathrm{CO}_{2} \)도 밤에 증가하였으며 관수할 때 증가하였다. ECps 및 sap flow rate는 낮에 증산량이 증가하면서 식물체 내수분 이동의 증가로 낮에는 증가하고 밤에는 감소하는 패턴을 보였다. 양분은 물과 함께 이동하기 때문에 ECps는 수액 이동이 증가하면서 증가하였다. 이전 연구에서 밤과 낮의 식물 줄기의 이온을 추출해 분석한 결과 양이온과 음이온의 함량이 밤보다 낮에 높은 것으로 나타났다. 토양의 수분 및 전기전도도 값은 관수를 하였을 때 급격히 증가하였다(Fig. 1).</p> <p>정상적인 생육 조건의 Brassica oleracea var. italica에서 전기전도도 및 sap flow rate는 상대습도 및 \( \mathrm{CO}_{2} \)와 음의 상관 관계가 있다. 낮에는 기온이 높아져 포화 수증기량이 증가하여 상대습도가 낮고, 기온이 낮은 밤에는 포화 수증기량이 감소하여 상대습도가 높다. \( \mathrm{CO}_{2} \)는 광이 있는 낮에 식물이 광합성을 하면서 대기 중의 \( \mathrm{CO}_{2} \)를 사용하여 대기 중의 \( \mathrm{CO}_{2} \) 함량을 감소시킨다. 따라서, 상대습도와 \( \mathrm{CO}_{2} \)가 낮은 낮에는, 광에 의한 증산속도가 증가하고 줄기를 통해서 물의 흐름인 sap flow rate가 증가한다. 식물체 내부에 물이 이동하면서 이온도 같이 이동하고 물과 이온의 수송이 증가함에 따라 이전 연구에서 낮에 Capsicum annuum의 내부 전기전도도가 증가함을 확인하였다. 반면에, 밤에는 온도와 광의 세기가 감소함에 따라, Brassica oleracea var. italica의 증산작용이 원활하지 않아 줄기의 ECps와 sap flow rate가 감소하였다. 상대습도 및 온도, 광의 세기와 같은 정상적인 생육 조건에 반응하여 Brassica oleracea var. italica의 ECps와 sap flow rate는 매일 올라갔다 내려가는 패턴을 보였다. ECps는 상대습도 및 온도, 광의 세기와 같은 기후조건과 관련이 있어 이 패턴에서 ECps의 편차는 식물 내에서 이상징후를 판단하는 기준이 될 수 있다.</p>	[ "정상적인 생육 조건 하에서 Brassica oleracea var. italica의 광합성유효광량자속밀도, 대기 온도 및 토양 온도는 낮에 증가하였으며, 상대습도와 \\( \\mathrm{CO}_{2} \\)는 밤에 증가하였으며 관수할 때 증가하였다. 낮에는 상대습도와 \\( \\mathrm{CO}_{2} \\)가 낮아 빛에 의한 증산속도와 sap flow rate가 증가한다." ]
55e-0c9-c1a8f98d-bdd3-4de0-a7f0-9f7c03b2a6f9	생명LA	브로콜리(Brassica oleracea var. italica)의 온도 스트레스 평가를 위한 다중 센서 모니터링	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>브로콜리의 생육 및 온도 스트레스 처리</h2> <p>농경지에서 채취한 토양과 상업용 상토를 \( 1: 1 \mathrm{v} / \mathrm{v} \) 비율로 혼합하고, 토양 살충제(Depucon, Farm Hannong) \( 4 \mathrm{~g} / \mathrm{kg} \)을 혼합물에 첨가하였다. 모판에서 5주간 자란 모종을 \( 3.6 \mathrm{~L} \) 화분에 \( 3 \mathrm{~kg} \)의 혼합 토양을 넣고 이식하였다. Brassica oleracea var. italica 모종은 스트레스 조건에 노출되기 전 화뢰가 생길 때까지 6주간 온실 조건에서 생육하였으며, 생육 기간 동안 포장용수량 상태로 관수하였다.</p> <p>Brassica oleracea var italica는 생장상에서 상대습도 \( 60 \% \), 16 간 광주기로 \( 20 / 15^{\circ} \mathrm{C} \) (주간/야간)에 4일 동안 노출시켰으며 이를 대조구로 하였다. 저온 처리의 경우, Brassica oleraceavar. italica은 생장상에서 초기에는 대조구와 같은 조건에 4일간 노출시켰다가 이후 4일 동안 상대습도 \( 60 \%, 16 \)시간 광주기로 \( 15 / 10^{\circ} \mathrm{C} \) (주간/야간)에 노출시켰다. 고온 처리의 경우, 다른 조건은 바꾸지 않고 온도를 \( 35 / 30^{\circ} \mathrm{C} \) (주간/야간)에 노출시켰다. 식물 반응(ECps, sap flow rate), 기후(온도, 상대습도, \( \mathrm{CO}_{2} \) ), 토양 조건(토양 수분함량, 토양온도, 전기전도도)을 실험 기간동안 모니터링하연다</p> <h2>Brassica oleracea var. italica의 ECps, Sap flow rate, 기후, 토양 환경 모니터링</h2> <p>저온 및 고온 스트레스 하에서 Brassica oleracea var. italica의 생리학적 변화를 모니터링하기 위해, 생장상에서 식물이 온도 스트레스 조건에 노출되는 동안 Junsmeter II (Prumbio, Suwon, Korea)를 사용하여 ECps를 측정하였다. 3개의 스테인 리스 바늘이 달린 2개의 전극을 Brassica oleracea var. italica 줄기의 양 측면에 삽입하였다. 두 전극에 전류를 공급한 후 브리지 회로 방법을 사용하여 저항을 측정했다. 전기 저항값은 데이터 로거(CR1000, Campbell Scientific, Logan, UT, USA)를 사용하여 15분마다 저장하였고, 수신된 데이터는 식 (1)에 따라 전기전도도로 변환하였다.</p> <p>\( \sigma=\frac{1}{R} \times \frac{L}{A}=\frac{1}{R} \times \frac{\pi r}{100} \)<caption>(1)</caption></p> <p>여기서 \( \sigma(\mathrm{S} / \mathrm{m}) \) 는 Brassica oleracea var. italica의 ECps, L은 측정된 Brassica oleracea var. italica 줄기 둘레의 절반 길이\( (\mathrm{mm}) \) 이고, \( \mathrm{R} \) 은 저항 \( (\Omega) \) 이며, \( \mathrm{A} \) 는 바늘이 삽입된 줄기의 단면적 \( \left(\mathrm{mm}^{2}\right), \mathrm{r} \) 은 Brassica oleracea var. italica 줄기의 반경 \( (\mathrm{mm}) \) 이다.</p> <p>Sap flow rate (Telofarm, Seoul, Korea)는 식물 줄기에 센서 를 한 개씩 삽입하여 2분간격으로 측정하였다. 기후는 광합성 유효광량자속 밀도(LightScout, Spectrum Technologies, Aurora, \( \mathrm{IL}, \mathrm{USA}), \mathrm{CO}_{2} \), 온도 및 상대습도를 측정하였다. 토양 조건은 각 화분마다 WaterScout SMEC 300 (Encosys, Anyang, Korea)으로 토양 수분함량( \(\%\) VWC), 토양온도 \( \left({ }^{\circ} \mathrm{C}\right) \), 전기전도도 \( (\mathrm{mS} / \mathrm{cm}) \)를 측정하였다.</p>	[ "식물 반응, 기후, 토양 조건을 실험 기간동안 모니터링하연다. 저온 및 고온 스트레스 하에서 Brassica oleracea var. italica의 생리적 변화를 살피기 위해 Junsmeter II로 ECps를 측정한다." ]
55e-0c9-20005952-de9b-430e-9c57-8870bde0f57d	생명LA	브로콜리(Brassica oleracea var. italica)의 온도 스트레스 평가를 위한 다중 센서 모니터링	<h2>서 론</h2> <p>지구온난화로 인해 폭염, 폭우, 가뭄, 한파 등과 같은 기상이변으로 인한 환경 스트레스는 세포 구조를 파괴하고 주요 생리기능을 손상시킬 수 있기 때문에 식물 성장에 영향을 미쳐, 작물 수확량의 감소로 이어질 수 있다. 기상이변과 같은 비 생물적 스트레스로 인한 식물 반응의 증상에는 괴사, 내부줄기 괴사, 꽃 괴사, 잎 시들음, 나무껍질 분열, 과일 부패 및 반점 등이 포함된다. 환경 스트레스를 받은 작물은 외부 증상이 즉시 나타나지 않으며 일반적으로 증상이 작물 외부에 나타날때 치료하면 식물이 회복하기에는 너무 늦다. 따라서 식물의 생리학적 상태를 파악하기 위해서는 다양한 분석방법을 통해 환경 스트레스에 대한 식물의 반응을 비파괴적으로 실시간 측정할 필요가 있다.</p> <p>온도 스트레스는 가뭄, 염분 스트레스와 동일하게 식물의 삼투압 스트레스를 유발하여 팽압 손실을 야기할 수 있다. 온도가 적합하지 않으면 단백질이 활동성을 잃거나 변성될 수 있고, 막이 무질서해질 수 있으며 활성산소(ROS)가 과도하게 생성되어 산화적 손상으로 이어질 수 있다. 결과적으로 세포 구조의 손상, 대사 기능 장애 및 광합성 억제는 조기 노화, 생식능력 저하 및 성장 장애의 원인이 된다.</p> <p>프롤린은 ROS 제거제, 삼투질 및 단백질의 구조를 안정화시키는 분자 샤페론(chaperone) 역할을 하여 스트레스로 인한 손상으로부터 세포를 보호한다. 식물이 저온, 고온, 중금속, 가뭄, 염분 또는 병원체에 의해 스트레스를 받으면 프롤린이 축적될 수 있다. 따라서 프롤린 함량은 식물의 생리적 조건을 모니터링하고 스트레스에 대한 식물의 저항성을 평가하는 데 유용한 지표이다. 그러나 이러한 분석은 오랜 시간이 걸리고 결과를 분석하기가 어려우며 식물의 파괴적인 샘플링을 필요로 한다. 또한 프롤린 분석은 샘플링한 시점의 식물 상태를 보여주는데 제한되어있기 때문에 실용적이지 않다.</p> <p>식물은 환경의 변화에 따라 반응하기 때문에 식물의 반응을 직접적으로 측정하지 않고 식물 생육 환경을 모니터링하여 식물의 반응을 예측하는 방법들이 있다. 기후변화를 측정하기 위해 조도, 온도 및 습도를 모니터링하며, 식물 뿌리가 있는 토양 수분의 상태를 모니터링하기 위해 토양 수분 장력계, Time Domain Reflectometry, 석고블럭 및 전기전도도 등의 방법을 사용한다. 또한, 이온 선택성 전극과 같은 화학 센서로 토양에 존재하는 영양 성분을 측정할 수 있다. 하지만, 이러한 환경 센서는 식물 생체 정보를 직접 모니터링하는 것이 아니며 환경이 식물마다 미치는 영향력이 다르기 때문에 환경 센서만으로 식물의 상태를 정확히 파악하는 것은 불가능하다. 한정된 환경계측 센서의 측정을 통해 식물의 상태를 정확하게 나타낼 수 없기 때문에 토양 조건 및 작물 생체 정보 센서의 추가 모니터링을 통해 종합적으로 보는 것이 필요하다.</p> <p>본 연구에서는 식물 줄기의 물이나 이온 수송을 반영하는 식물의 내부 전기전도도 \( (\mathrm{ECps}) \) 와 sap flow rate를 모니터링하여 온도 스트레스에 대한 식물의 생리학적 반응을 분석하였다. 식물 세포의 전기적 특성은 성장 단계, 세포 구조, 영양소 및 물과 온도와 관련된 조건에 따른 식물 생리학적 상태를 평가하는 데 사용될 수 있다. 식물 줄기의 내부 전기전도도는 환경 조건의 변화에 반응한다. 따라서 식물의 내부 전기전도도를 모니터링하면 스트레스를 받는 조건하에서 식물이 겪는 생리학적 변화를 이해하는 데 도움이 될 수 있다. Sap flow rate 계측은 농업, 원예, 임업 및 생태학에서 환경에 따른 식물의 수분 흡수능력을 평가하는데 활용되고, sap flow rate 측정을 통해 경작 가능한 작물, 과수원, 산림 농장 및 자연 식생의 물 사용량을 정량화하고, 관수량을 결정하는데 활용한다. 따라서 본 연구에서는 식물 줄기 내부의 전기전도도와 sap flow rate를 측정하 면서 동시에 온도, 상대습도, 광합성유효광량자속 밀도(Photosynthetic Photon Flux Density, PPFD), \( \mathrm{CO}_{2} \) 등 식물생육 기후조건을 모니터링하였고, 토양의 온도, 수분함량, 전기전도도를 모니터링하여 토양 상태도 측정하였다. 이 연구의 목적은 저온과 고온 스트레스 하에서 Brassica oleracea var. italica의 생리적 반응을 조기에 발견하기 위해 식물 내부 전기전도도를 포함한 다양한 센서의 적용 가능성을 평가하는 것이다.</p>	[ "기상이변으로 인한 이상증후로부터 발생되는 환경 스트레스는 세포 구조를 파괴하고 주요 생리기능을 손상시켜 식물의 성장에 영향을 주고 이어 작물 수확량의 감소를 야기할 수 있다. 이러한 문제를 방지하기 위해 식물의 생리학적 상태를 다양한 분석방법을 통한 환경 스트레스의 식물의 반응을 미리 파악해야한다. 따라서 본 연구에서는 식물 줄기 내부의 전기전도도와 sap flow rate를 분석하고 온도, 상대습도, 광합성유효광량자속 밀도(Photosynthetic Photon Flux Density, PPFD), \\( \\mathrm{CO}_{2} \\) 등 식물생육 기후조건, 토양의 온도, 수분함량, 전기전도도와의 관련성을 파악하고 다양한 센서의 적용 가능성을 평가하였다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-2918-46e0-bb7a-d67582cd15b6_02	생명LA	계피(Cinnamomum zeylanicum ) 정유의 유제 및 입제의 잉어(Cyprinus carpio) 및 제브라피쉬에 대한 생태독성	<h2>계피 유제의 제브라피시 배아에 대한 생육초기독성</h2> <p>수증기 추출한 고수 유제의 제브라피시 배아 생육초기독성 실험을 위해 수증기 추출법을 이용한 고수 정유를 시용해 제형화한 유제를 유효성분이 \( 10 , 50 , 100 , 250 , 500 \mathrm { mg } \mathrm { L } ^ { -1 } \) 가 되도록 처리하여 총 \(5 \)의 실험군으로 나누어 생육 초기 독성 시험을 실시 하였다. 실험실에서 계대 사육 및 순화시킨 제브라피시의 배아 중 산란된 시간이 \(6 \) 시간 이상 차이나지 않는 건강한 개체를 선별하여 독성실험에 사용하였다. Egg water (천일염 \( 1 \% \) 수용액)를 패트리디시에 채워 \(20 - 28 \)도의 온도를 유지하여 각 패트리디시 당 \(30 \) 마리를 처리허여 반지수식으로 실험을 \(72 \) 시간 동안 수행하였다. \(72 \) 시간 동안 부화 및 생존한 치어는 \(72 \) 시간 경과 후 염소를 제거한 수돗물 \( 2 \mathrm { ~L } \) 를 \( 3 \mathrm { ~L } \) 비커에 채워 \( 20\sim28 \mathrm { C } \) 의 온도를 유지하여 반지수식으로 실험을 \(7 \) 일 동안 수행하였다. 실험도중의 치사개체는 발견 즉시 제거하였으며, 치사량 및 부화율을 \(24 \) 시간 단위로 즉정하여 치사량은 \(10 \) 일 그리고 부화율은 \(72 \) 시간 동안 기록하였다. 각 패트리디시 및 비커의 물은 \(24 \)시간마다 갈아주었으며, 하루에 \(2 \)회 이상 먹이(브라인슈림프)를 급여하였다. 패트리디시 및 비커 네의 용존산소량, \( \mathrm { pH } \), 온도, 경도, 알칼리도는 \(24 \) 시간 단위로 총 \(10 \) 일 동안 측정하여 기록하였다.</p> <h2>계피 수증기 증류 추출 정유 유제의 제브라피시에 대한 만성 독성 실험</h2> <p>수증기 추출한 계피 유제의 제브라피시 성체 만성 독성 실험을 위해 수증기 증류 추출법을 이용한 계피 정유를 사용해 제형화한 유제를 유효성분이 \( 10 , 50 , 100 , 250 , 500 \mathrm { mg } \mathrm { L } ^ { -1 } \) 가 되도록 처리하여 총 \(5 \) 개의 실험군으로 나누어 시험을 실시하였다. 구입한 제브라피시를 실험실에서 \( 1 \) 주일 이상 순화 시킨 후, 전장 \( 2-3 \mathrm { ~cm } \) 의 건강한 개체를 선별 하여 독성 실험에 사용 하였다. 염소를 제거한 수돗물 \( 3 \mathrm { ~L } \) 를 \( 3 \mathrm { ~L } \) 비커에 채워 \( 20 - 28 \) 도의 온도를 유지 하여 각 비커 당 \( 10 \) 마리의 제브라피시를 처리해 반지수식으로 실험을 \( 45 \) 일 동안 수행 하였다. 각 비커의 물은 일주일에 \( 3 \) 회 갈아 주었으며 하루에 \( 2 \) 회 이상 먹이 (브라인슈림프) 를 급여 하였다. 페트리디시 및 비커 내의 용존산소량, \( \mathrm { pH } \), 온도, 경도, 알칼리도는 물을 갈아줄 때마다 총 \( 45 \) 일 동안 측정하여 기록 하였다.</p> <h2>통계분석</h2> <p>실험에서 얻어진 결과 값은 통계 프로그램(SPSS)의 프로빗(Probit)프로그램을 이용하여 \( 95 \% \) 신뢰 한계에서 반수치사농도 \( \left ( \mathrm { LC } _ { 50 } \right . \) )를구하였다. 실험군 간의 유의성을 비교 하기 위하여 \( t \)-test \( (p \) \( >0.05) \) 를 수행 하였다.</p>	[ "고수 유제의 제브라피시 배아에 대한 독성 시험을 위해 수증기 추출법을 이용해 고수 정유로 제형화한 유제를 사용했다. 유제의 유효성분이 \\(10, 50, 100, 250, 500 \\, \\mathrm{mg} \\, \\mathrm{L}^{-1}\\)이 되도록 처리하여 5개의 실험군을 설정하였고, 72시간 동안 부화 및 생존한 치어를 관찰했다. 실험은 7일 동안 반지수식으로 진행되었으며, 치사량과 부화율은 각각 10일과 72시간 동안 기록하였다. 이후 통계 프로그램 SPSS의 Probit 프로그램을 사용해 95% 신뢰 한계에서 반수치사농도(\\(LC_{50}\\))를 계산하였고, 실험군 간 유의성을 \\(t\\)-test로 비교하였다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-2918-46e0-bb7a-d67582cd15b6_01	생명LA	계피(Cinnamomum zeylanicum ) 정유의 유제 및 입제의 잉어(Cyprinus carpio) 및 제브라피쉬에 대한 생태독성	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시험물질</h2> <p>시험에 사용된 계피 정유는 전북대학교 이희선 교수께서 수증기 증류법, 핵산을 이용한 용매추출법, 그리고 초임계 추출법을 이용하여 추출한 정유를 제공받아 사용하였다. 상용화된 계피 정유를 Mother and Daughters(포천, 경기도)사로부터 구입하여 사용하였다. 사용된 유화제로는 Castor oil, Tween \(80 \), Triton X- \( 100 \), Tergitol, Nonidet 등의 비이온계 계면활성제와 음이온성 계면활성제로서 Sodium dodecyl sulfate (SDS) 와 sodium dodecylbenzene sulfonate 등의 \( 2 \)종이 사용 되었으며 모두 Sigma-Aldrich사(St Louise, MO, USA)로 부터 구입하였다.</p> <h2>시험생물</h2> <p>본 어독성 실험에 사용된 잉어(Cyprimus carpio)는 오창양어장 (오창, 충북, 대한민국)으로 부터 구입하여 경북대학교 실험실에서 \(1 \)주일 이상 순화시킨 것으로 사용하였다. 실험에 사용된 잉어의 전장은 최소 \( 3-5 \mathrm { ~cm } \) 로 건강한 개체를 선별 하였다. 시험 실시 \(24 \)시간 전부터 잉어에 대한 먹이공급을 중단하고 사용된 물은 염소를 제거한 상태의 물을 사용하였다.</p> <h2>유제 및 입제의 제조</h2> <p>유제의 품질관리를 위해 정유의 비중들을 측정하였고 그를 바탕으로 유제의 비중들을 측정하였다. 정유 유제를 제형화하기 위하여 에탄올을 용제로 사용하였고 유화제와의 최종 제형 비를 \( 5:1:4 \) (정유 : 유화제 : 에탄올)로 설정하여 제조하였다. 비이온성 계면활성제는 이온성 계면활성제에 비하여 피부자극이 적고 유효성분에 영향을 끼치지 않는 것으로 알려져 있다. Tergitol를 선정하여 실험을 수행하였다. 계면활성제가 물과 기름에 대한 친화성 정도를 나타내는 값인 \( \mathrm { HLB } \) 값의 범위가 (8 \) 에서 \(15 \) 사이인 비이온성 계면활성제를 사용하였고, 선택한 계면활성제는 미국 \( \mathrm { EPA } \operatorname { LST } 3,4 \) 에 농약의 보조제로서 사용이 허가되어 있다.</p> <p>Zeolite를 사용하여 유제를 흡유시켜 입제를 제조 하였으며 입제의 입자별 중량과 흡유능을 고려하여 Zeolite의 적정 크기를 설정 하였다. 선택한 담체는 미국 EPA LIST \(3, 4 \) 에 농약의 보조제로서 사용가능 하였고, Zeolite의 흡유능에 따라 최종 제형 비를 \(1:9 \) (유제 : Zeolite)가 되도록 제조하였다.</p> <h2>계피정유 원제, 유제, 입제의 잉어에 대한 급성어독성 실험</h2> <p>농촌진흥청 환경생물 독성 시험 기준과 방법(제 \(5 \)조 제 \(1 \)항 제 \(4 \)호)에 따라 잉어에 대한 급성 독성 실험을 실시 하였다.계피원제의 잉어 급성 독성 실험을 위해 수증기, 핵산, 초임계 추출법을 이용하여 획득한 정유와 아세톤을 무게 비 \( 50: 50 \) 으로 혼합하였다. 추출법 별로 유효 성분이 \( 10 \mathrm { mg } \mathrm { L } ^ { -1 } \) 이 되도록 처리할 경우 사용되는 계면활성제 양을 계산 하여 Tergitol을 사용 하여 급성 독성 시험을 실시 하였다.</p>	[ "수증기 증류법, 핵산을 이용한 용매추출법, 그리고 초임계 추출법을 이용하여 추출한 계피 정유를 사용하여 유제 및 입제를 제조하였다. 실험에 사용된 잉어는 오창양어장에서 구입하여 건강한 개체를 선별하였고, 유화제로는 비이온계 계면활성제와 음이온성 계면활성제를 사용하였다. Zeolite를 사용하여 유제를 흡유시켜 입제를 제조하였으며, EPA LIST 3, 4에 농약의 보조제로서 사용가능한 담체를 사용하여, 농촌진흥청 환경생물 독성 시험 기준과 방법에 따라 계피원제의 잉어에 대한 급성 독성 실험을 실시하였다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-2918-46e0-bb7a-d67582cd15b6_00	생명LA	계피(Cinnamomum zeylanicum ) 정유의 유제 및 입제의 잉어(Cyprinus carpio) 및 제브라피쉬에 대한 생태독성	<h1>서 론</h1> <p>계피(Cinnamomum verum) 나무껍질로부터 추출한 정유 (Essential oils)는 향신료로 주로 사용되어지고 민간치료요법에서도 이용되어왔다. 이들 정유는 식중독을 일으키는 다양한 박테리아에 대하여 항균활성이 뛰어나며 아플라톡신(Aflatoxins)을 생산하여 식품 및 저장 곡물에 주로 오염시키는 Aspergillus flavus 또는 A. fumigatus 등의 곰팡이에 대한 살균 또는 생장 억제 효과를 지니고 있다고 보고되었다. 이들의 동물에 대한 생리활성은 당뇨병 쥐의 총 콜레스테롤 함량, 저밀도지질 (low-density lipids) 및 중성지방(triglycerides)의 농도를 조절하는 기능이 알려졌다. 흥미롭게도 대부분의 계피의 생리활성은 주로 정유형태로 존재할 때 보고된 바가 많으며 이들은 상업적으로도 쉽게 구입할 수 있다.</p> <p>계피정유는 주로 수증기증류법(steam distillation)으로 추출되어지며 이들의 주요성분으로는 모노테르펜으로서 cinnamaldehyde가 약 \( 92 \% \) 정도 존재하는 것으로 보고되었다. 이 계피 정유의 항균작용으로는 균 세포안의 전해질의 누설현상 유도 및 대사작용의 저하로서 확인되었으며, 이러한 항균작용과 더불어옥수수바구미(Sitophilus zeamais)에 대한 살충 및 기피작용을 나타내었다. 살충효과는 농업해충에서도 발견되었으며 실험에 사용된 농업해충으로는 복숭아혹진딧물(Myzus persicae), 배추좀나방(Plutella xylostella), 및 점박이 응애(Tetranychus urticae) 등이었다. 이러한 살충효과를 보고한 논문은 특이하게노 정유를 세가지 다른 방법을 이용하여 추출하였으며 이는 수증기 증류법, 용매추출법(solvent extraction), 및 초임계추출법(supercritical extraction) 등이었다. 수증기증류법 및 핵산을 이용한 용매추출법으로 추출한 계피정유는 각각 복숭아혹진딧물에 대해서 \( 5.96 \) 및 \( 4.64 \mu \mathrm { g } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \) 의 살충효과를 나타내었다. 그러나, 정유는 강한 휘발성분인 모노테르펜으로 주로 구성되어 있으므로 이들을 쉽게 농업적인 목적으로 사용하기 어려운 단점이 있다. 이러한 단점을 극복하여 이들을 농업 해충 등을 박멸하기 위한 제형으로 여러 제형 형태를 개발하였다. 키토산을 이용한 나노캡슐화 방법 및 유제화하여 사용하는 방법등이 고안되었다. 또 다른 형태의 제형으로 최근에는halloysite 나노튜브에 정유를 캡슐화한 후 이들의 방출량을 조절한 경우가 보고되었다.</p> <p>국내에서는 이려한 정유의 제형을 농업적인 목적으로 시용하기 위하여 이 제형의 안전성 (safety) 를 시험헤야 하며 주로 비표적 (non-target) 곤총인 꿀벌 및 민물에 서식하는 잉어 및 미꾸라지를 활용 한다. 따라서, 본 연구는 다양한 추출 방법으로 얻은 계펴정유의 각각의 두 제형(입제와 유제)에 대한 잉어 (Cyprinus carpio) 를 이용한 급성 독성(acute toxicity), 잉어 및 제브라퍼수(Danio rerio)를 이용한 만성독성(Chronic toxicity), 마지막으로 꿀벌(Apis mellifera)을 이용한 엽상 잔류 독성 (honeybee acute and residual toxicity)을 실험하여 이들 정유의 제형이 생테 및 환경에 미칠 영향을 평가 하였다.</p>	[ "계피 나무 껍질로부터 추출한 정유는 향신료와 민간치료에 사용되며, 다양한 박테리아와 아플라톡신을 생성하는 Aspergillus flavus 등의 곰팡이에 대해 항균 및 생장 억제 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 계피 정유는 주로 수증기증류법으로 추출되며, 그 중 약 92%가 신나말데하이드인 모노테르펜으로 구성되어 있다. 하지만, 이런 정유의 농업적 활용에는 휘발성분의 강함이 문제가 되고, 그 안전성 평가를 위해 국내에서는 꿀벌과 잉어, 미꾸라지 등을 사용하여 실험하고 있다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-2918-46e0-bb7a-d67582cd15b6_05	생명LA	계피(Cinnamomum zeylanicum ) 정유의 유제 및 입제의 잉어(Cyprinus carpio) 및 제브라피쉬에 대한 생태독성	<p>잉어에 대한 계피정유 유제의 급성어독성은 Table \( 2 \)에 나타내었다. 수증기 증류법으로 추출된 정유는 \( 48 \) 시간 동안 잉어에 노출되었을 때 \( \mathrm { LC } _ { 50 } \) 값이 \( 8.37 \mathrm { mg } \mathrm { L } ^ { -1 } \) 수준이었으며 \( 96 \) 시간에서 \( 8.26 \mathrm { mg } \mathrm { L } ^ { -1 } \) 으로 나타났다. 이는 \(48 \) 시간 이후 \(96 \) 시간까지 치사개체가 더 발생하였음을 의미한다. 핵산을 이용한 용매 추출 법으로 획득한 계피 정유의 경우 \( 48 \) 시간 동안 노출시켰을 때 \( \mathrm { LC } _ { 50 } \) 값이 \( 6.30 \mathrm { mg } \mathrm { L } { } ^ { 1 } \) 이었으며 \(96 \) 시간 노출시켰을 때의 \( \mathrm { LC } _ { 50 } \) 값은 \(6.14 \)로 역시 \( \mathrm { LC } _ { 50 } \) 값이 감소되었다. 이러한 결과를 토대로 계피 정유의 유제 형태는 용매 추출법으로 추출된 정유의 형태가 수증기 추출법으로 추출한 정유보다 더 강한 독성을 나타내었다. 또한 초임계 추출로 추출한 정유의 경우 \( \mathrm { LC } _ { 50 } \) 값이 \( 6.16 \mathrm { mg } \mathrm { L } ^ { -1 } \) 이었으며 \(96 \) 시간의 \( \mathrm { LC } _ { 50 } \) 값은 \( 6.03 \mathrm { mg } \mathrm { L } \) 으로 시간이 경과함에 따라 독성이 더 강하게 나타났고 초임계 추출로 추출 정유의 성분들 중에 강한 독성을 일으키는 성분이 유제 형태로 존재할 때 보다 더 효과적으로 독성을 나다내고 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과는 향후 원제를 제제화 하여 사용할 때 환경 중 수서생태계에 미치는 영향을 필히 실시해야 함을 입증하였다.</p> <p>이와 비슷하게 농업해충인 배추좀나방에 대한 계피정유를 함유한 친환경유기농자재 소재 중 이들의 유제에 대한 생태독성평가를 실시하여 잉어에 대한 급성독성이 \( 1.9 \mathrm { mg } \mathrm { L } ^ { -1 } \)로 나타나어독성 II급으로 판명된 바 있다. 그러나. 이 제형은 계피정유 만으로 유효성분을 구성하지 않고 후추에서 유래된 정유를 함유함으로써 잉어에 대한 급성어독성이 계피정유 만으로 발생한 독성으로 보기에는 무리가 있다고 보여진다.</p>	[ "잉어에 대한 계피정유 유제의 급성어독성은 용매 추출법으로 추출된 형태가 수증기 추출법보다 강하게 나타났다. 또한, 배추좀나방에 대한 계피정유를 함유한 친환경유기농자재의 생태독성평가에서 잉어에 대한 급성독성이 \\( 1. 9 \\mathrm { mg } \\mathrm { L } ^ { -1 } \\)로 나타나 II급으로 판명되었다. 그러나 이 제형은 계피정유 외에도 후추에서 유래된 정유를 함유하고 있어, 잉어에 대한 급성어독성이 계피정유만으로 발생한 것으로 보기엔 제한이 있다." ]
55e-0c9-d4970d9b-3c52-468c-a380-4b17db2071e6_01	생명LA	산수유의 지표성분 함량과 입지환경과의 상관관계 분석	<h2>지표성분과 입지환경과의 상관관계 분석</h2> <p>Park 등이 보고한 산수유 주산지 환경조사 결과에 따르면 산수유는 일교차가 크고, 해발고도 \( 100-400 \mathrm { ~m } \) 내의 남동향 지대에서 결실율이 좋으며 토양조건은 배수가 잘된 사질토로서 약산성 \( \left ( \mathrm { pH } 6.2-6.6 \right ) \)이며 경사 \( 15 ^ {\circ } \) 이내로서 한파의 영항이 크지 않은 지대에 적응하고 있다고 하였다. Morroniside와 loganin의 재배환경간 상관관계 분석한 건과(Table 5), loganin과 토양 데이터 중 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 함량과 \( \mathrm { pH } \)가 가장 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 토양의 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 함량은 loganin과 양의 상관관계, \( \mathrm { pH } \) 는 loganin과 음의 상관관계인 것으로 확인되었다. 산수유 지표성분인 Morroniside와 토양 데이터 중 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 함량, \( \mathrm { Na } ^ { + } \)함량, \( \mathrm { pH } \), 염도, silt 비윤, clay 비율이 가장 큰 영향을 미치는 것으로. 확인되었다. 이러한 인자들은 일반적으로 작물의 양분 흡수와 관련이 있고, 식물의 생육에 영향을 미치므로 지표성분과도 높은 상관관계가 있는 것으로 보인다. 따라서 토양 데이터 중 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 함량, \( \mathrm { pH } \), clay 비율이 산수유의 지표물질인 morroniside와 loganin의 함량에 높은 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 토양의 \( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \) 함량이 \( 2.93 \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \) 이상일 때, \( 0.9 \% \) 이상의 loganin 함량을 나타내고, 토양의 silt 비율이 \( 17.88 \% \) 이하이고, \( \mathrm { K } \) 함량이 \( 0.45 \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \) 이하일 때, morroniside 함량이 \( 0.9 \% \) 이상인 것으로 예측된다. 결론적으로 본 연구에서는 산수유의 지역별 지표성분 함량을 분석하였고, 재배 토양환경에 따른 loganin, morroniside 함량의 상관관계를 분석하였다. 이를 통해 산수유나무의 최적의 재배환경요건에 대한 기초자료를 제공할 수 있을 것이다.</p>	[ "본 연구는 산수유의 지역별 지표성분 함량과 재배 토양환경에 따른 morroniside와 loganin의 함량과의 상관성을 분석하였다. 특히, loganin의 경우 토양의 \\( \\mathrm { Mg } ^ { 2 + } \\) 함량과 \\( \\mathrm { pH } \\)가 큰 영향을 끼치는 것으로 확인되었다. 이러한 요소들은 작물의 양분 흡수와 직접적으로 연관되어 있고, 식물의 생육에 중요한 역할을 하는 것으로 파악되었다." ]
55e-0c9-d4970d9b-3c52-468c-a380-4b17db2071e6_00	생명LA	산수유의 지표성분 함량과 입지환경과의 상관관계 분석	<h1>결과 및 고찰</h1> <h2>지표성분 합량 분석</h2> <p>산수유의 품질 및 특성평가를 위한 지표성분인morroniside는 급성심근경색, 저혈당, 신경세포 보호 효과가 있다고 알려셔 있으며, loganin은 항엽증, 면역 증진, 기억력 증진 및 개선 효과 등의 효능이 있다고 보고되어 있다. 산수유의 지표 성분인 morroniside 및 loganin 표준용액을 이용하여 검량선을 작성한 결과 morroniside 및 loganin의 상관계수 \( \left ( \mathrm { R } ^ { 2 } \right ) \) 값은 모두 0.999 이상으로 우수한 지선성을 보있다. 산수유 추출물의 UPLC chromatogram을 비교하여 패크가 정화히 분리되는지 확인한 결과(Fig. 3), 피크 유지시긴(retention time, RT)은 각각 morroniside 2.7분, loganin 4.2분으로 일치하였다. 또한, 19 지역에서 수집된 산수유의 지표성분 함량을 분석한 결과(Table 2), 수집된 지역에 따라 morroniside와 loganin 성분 함량 차이가 났다. 재배지별로 morroniside의 함량은 적게는 \( 0.37 \% \), 많게는 \( 1.5 \% \) 로. 약 4배 이상 차이가 났고, loganin함량은 적게는 \( 0.27 \% \), 많게는 \( 1.35 \% \)로 약 5 배 차이가 났다.</p> <h2>재배지 토양환경 분석</h2> <p>산수유나무 재배지의 토양 이화학성을 조사한 결과, Table 3 과 같이 유기물함량(organic matter, \( \mathrm { OM } \) )은 0.7-11.36 \( \% \), 전질소 함량 (total nitrogen, TN)은 \( 0.06-0.39 \% \), 유효인산(available phosphate, Av. P)은 \( 35.22-957.07 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \), potassium \( \left ( \mathrm { K } ^ { + } \right ) \) 는 \( 0.10-0.79 \mathrm { cmol } ^ { + } / \) \( \mathrm { kg } \), calcium \( \left ( \mathrm { Ca } ^ { 2 + } \right ) \)는 3.2-12.95 \( \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \), magnesium \( \left ( \mathrm { Mg } ^ { 2 + } \right ) \) 은 \( 0.73-5.87 \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \), sodium \( \left ( \mathrm { Na } ^ { + } \right ) \) 는 \( 0.02-0.20 \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \), 양이온치환용량(cation exchange capacity, CEC)은 10.08-28.61 \( \mathrm { cmol } ^ { + } / \mathrm { kg } \) 로 나타냈다. Table 4와 같이 \( \mathrm { pH } \) 는 4.97-6.89로 약산성, 전기전도도(cloctrical conductivity)는 \( 0.04-0.21 \mathrm { dS } / \mathrm { m } \), 염도(salinity)는 0.002-0.006 \( \% \), 토성은 양질사토 사양도로. 나타났다.</p>	[ "산수유의 지표성분인morroniside는 급성심근경색, 저혈당, 신경세포 보호 효과가 있다고 알려셔 있으며, loganin은 항엽증, 면역 증진, 기억력 증진 및 개선 효과 등의 검증을 위하여 morroniside 및 loganin 표준용액을 이용한 검량선을 작성한 결과 morroniside 및 loganin의 상관계수 \\( \\left ( \\mathrm { R } ^ { 2 } \\right ) \\) 값은 모두 0.999 이상으로 우수한 직선성을 보인다. 19 지역에서 수집된 산수유 지표성분 함량을 분석한 결과,지역에 따라 morroniside와 loganin 성분 함량 차이가 4배~5배정도 났다." ]
55e-0c9-02f3d6e8-8d7e-4d8a-9c5f-ccb5f6752015	생명LA	딱지꽃(Potentilla chinensis ) 뿌리 추출물의 주요성분 분리동정	<h2>재료 및 방법</h2> <h3>실험재료</h3><p>본 실험에 사용된 딱지꽃은 정선 배서영농존합과 진 주 영농조합법인 이노플랜트 두 곳에서 수급하여 사용하였다.</p><h3>시약 및 기기</h3><p>딱지꽃의 HPLC 분석은 waters \( 1525 \mu \) binary HPLC pump, waters 996 photodiode array detector를 사용하였고, 사용된 컬럼은 gemini C18 \( (5 \mu \mathrm{m}, 4.6 \times 250 \mathrm{~nm} \), phenomenex, Madrid Avenue Torrance, CA, USA) column을 사용하였다. 그리고 주요성분을 분리정시에는 waters \( 600 \mathrm{E} \) system, waters 484 detector, phenomenex C18 \( (5 \mu \mathrm{m}, 20.2 \times 300 \mathrm{~mm}) \) column 을 사용하였다. NMR 분석은 Bruker사의 \( 400 \mathrm{MHz} \mathrm{NMR} \) 을 사용하였다. 그리고 Mass 분석은 MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight)를 이용하였으며 Perseptive Biosystem 사의 Voyager-De STR의 모델을 사용하였으며 matrix로 \( \alpha \)-cyano-4-hydroxycinnamic acid를 사용하였다.</p><h3>딱지꽃 뿌리 추출 방법</h3><p>추출을 위하여 딱지꽃 시료를 \( 60^{\circ} \mathrm{C} \) 에 서 2 일 동안 건조하였고, 각각 정제수 \( (2 \mathrm{~L}) \), 메탄올 \( (2 \mathrm{~L}) \), 아세트 산에틸(2 L), 헥산( \( 2 \mathrm{~L}) \) 을 사용하여 추출하였다. 추출 시 농도는 \( 2 \mathrm{~g} / \mathrm{L} \) 로 추출한 후, 여과하여 그 액을 실험에 사용하였다.</p><h3>딱지꽃 추출물의 HPLC 분석 및 정제</h3><p>딱지꽃 뿌리 추출물을 추출용매에 따른 주요성분을 HPLC로 분석하였다. 분석 조건은 \( 0.1 \% \) 삼불화아세트산(trifluoroacetic acid, TFA)를 포함한 정제 수 \( ( \) 용매 \( \mathrm{A}) \) 와 아세토나이토릴(용매 \( \mathrm{B}) \) 를 사용하였고 \( 1 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) (분석시) 흑은 \( 5 \mathrm{~mL} / \mathrm{min} \) (분라몽정시) 유속으로 \( 254 \mathrm{~nm} \) 파장에서 분석하였다.</p><h3>NMR (Nuclear Magnetic Resonance) 분석</h3><p>정제된 딱지꽃 뿌리 주출물 주요 피크를 동결건조 시킨 후 연한 노란색의 파 우더를 확보한 다음 \( \mathrm{CDCl}_{3} \) 에 녹여 분석을 수행하였다. 화합물 (1) (400 MHz NMR, \( \left.\mathrm{CDCl}_{3}\right) \delta 4.40(\mathrm{~s}, 3 \mathrm{H}), 4.22 \) (s, 3H), \( 4.10(\mathrm{~s}, 3 \mathrm{H}), 7.55(\mathrm{~s}, 1 \mathrm{H}), 7.75(\mathrm{~s}, 1 \mathrm{H}) \)</p><h3>Mass spectrometry 분석</h3><p>정제된 딱지꽃 뿌리 추출물 주요 피 크를 동결건조 시킨 후 연한 노란색의 파우더를 확보한 다음 메탄올에 녹인 후 \( \alpha \)-cyano-4-hydroxycinnamic acid와 섞고 MALDI-TOF MS를 이용하여 분석을 수행하였다. 화합물 (1) MALDI-TOF \( \mathrm{MS} \) calcd for \( \mathrm{C}_{17} \mathrm{H}_{12} \mathrm{O}_{8}\left[\mathrm{M}+\mathrm{H}]^{+}=345.8\right. \), found \( 345.8 \).</p>	[ "본 실험에서 딱지꽃은 정선과 진주 영농조합법에서 수급하여 사용하였다. 딱지꽃 추출물의 HPLC 분석 및 정제. 딱지꽃 뿌리 추출물을 추출용매에 따른 주요성분을 HPLC로 분석하였다. 정제된 딱지꽃 뿌리 주출물 주요 피크를 동결건조 시킨 후 연한 노란색의 파 우더를 확보한 다음 CDCl3 에 녹여NMR 분석을 수행하였다. Mass spectrometry 분석은 정제된 딱지꽃 뿌리 추출물 주요 피 크를 동결건조 시킨 후 연한 노란색의 파우더를 확보한 다음 MALDI-TOF MS로 분석을 수행하였다." ]
55e-0c9-6adc52dc-20a5-4189-9add-11e60ddb58d8	생명LA	딱지꽃(Potentilla chinensis ) 뿌리 추출물의 주요성분 분리동정	<h2>결과 및 고찰</h2> <p>딱지꽃 뿌리 추출물의 HPLC 분석. 딱지꽃 뿌리에서 용매별 추출물의 주요. 성분 차이를 비교하기 위하여 HPLC를 이용하여 분석하였다. 그 걸과 아세트산에틸과 헥산 을 이용하여 추출한 추출물과 달리 정제수, 메탄올, 부탄올에서 추출된 추출물에서 일정한 주요 피크(22.2 분)를 확인할 수 있었다(Fig. 1). 본 연구에서는 정제수 및 알코올류 용매에서 주요하게 추출되는 주 요 성분(retention time: 22.2분)을 분리 동정하였다. NMR 및 MALDI-TOF MS를 통한 딱지꽃 뿌리추출물의 주요 피크 구조 분석. HPLC를 통해 정제된 딱지꽃 뿌리추출물의 22.2분 주요 피크를 \( { }^{1} \mathrm{H} \) NMR 분석을 수행하였다. 그 결과 \( \delta \) \( 4.10,4.23,4.40 \mathrm{ppm} \) 에서 단일선과 \( 7.51,7.76 \mathrm{ppm} \) 에서 단일선 의 수소 피크를 확인하였다. \( { }^{1} \mathrm{H} \) NMR분석에서 확인된 \( 4.10 \), \( 4.23,4.40 \mathrm{ppm} \) 의 단일선은 3개의 메톡시 \( \left(-\mathrm{OCH}_{3}\right) \) 기의 피크로 예상하였고, \( 7.51,7.76 \mathrm{ppm} \) 의 singlet은 방향족 고리의 수소피크 로 예상되었다. 이러한 결과를 토대로 문헌상에 확인된 딱지꽃 성분 중 가장 유사한 \( \mathrm{NMR} \) 결과를 가진 물질이 2,3,8-tri- \( O \) - methylellagic acid (1)임을 확인 할 수 있었다(Kim, 1989). 이를 확인하기 위해 시중 구입 가능한 2,3,8-Tri- \( O \)-methylellagic acid (1)를 구입하여 동일한 조건으로 ' \( { }^{1} \mathrm{H} \) NMR data를 확인한 결과 비슷한 결과를 확인하였다(Table 1). 추가적으로 분리된 주요물질의 분자량을 MALDI-TOF MS를 이용하여 분석 함으로써 화함물 (1)과 동일한 물질인지 확인하 였다. 그 결과 분자량 \( [\mathrm{M}+\mathrm{H}]^{+}-345.8 \) 를 확인함으로써 화합물 (1)의 분자량과 일치함을 알 수 있었다. 위 결과들을 바탕으로 딱지꽃의 뿌리에서 추출된 주요 물질 이 2,3,8-Tri- \( O \)-methylellagic acid (1)임을 확인하였다(Fig. 2). 문헌 화함물 (1)은 주로 항균작용을 물질로 알려저 있음을 확인하였다(Ndukwe와 Zhao, 2007). 딱지꽃 뿌리에서 용매별 추출물의 2,3,8-tri- \( O \)-methylcllagic acid (1) 함량 분석. 용매에 따른 딱지꽃 뿌리추출물에서의 화 합물 (1)의 함량을 분석하기 위해 시중 구입 가능한 화합물 (1) 을 \( 100,200,300 \mathrm{ppm} \) 농도로 제조 후 HPLC를 이용하여 표 준곡선(standard curve)를 만들었다. 이를 이용하여 각 용매별로 추출된 화합물 (1) 앙을 정량한 걸과 메탄올 \( 643.5 \mathrm{ppm} \), 정제수 \( 319.0 \mathrm{ppm} \), 부탄올 \( 153.1 \mathrm{ppm} \), 아세트산에틸 \( 2.8 \mathrm{ppm} \), 헥산 0 \( \mathrm{ppm} \) 을 확인되었다. 이 결과를 바탕으로 화합물 (1)은 뿌리에 서 메탄올을 이용하여 추출 시 가장 많은 양이 추출된다는 것 을 알 수 있다(Table 2). 본 연구에시는 그 동안 연구가 미비했던 딱지꽃의 뿌리의 추출물의 주요성분을 2,3,8-Tri- \( O \)-methylellagic acid로 분리동정 하였다. 화합물 (1)은 문헌 조사결과 항균활성에 중요한 역할을 미치는 물질임이 알려져 있었다. 또한 산업적응용을 위헤 용매 별로 화합물 (1)의 추출양을 정량함에 따라 메탄올이 최적의 추출용매임을 확인하였다.</p> <h2>초 록</h2> <p>딱지꽃(Potentilla chinensis)은 약소식물의 하나로 항염, 지혈, 해 독 그리고 해열 등의 효과가 알려져 있다. 특히 딱지꽃의 뿌리 는 약제로써 중요한 가치를 지니고 있다. 그러나 기존에 딱지 꽂의 줄기나 잎에 대한 유효성분에 대한 연구가 시도된 반면 딱지꽃의 뿌리의 주요성분을 분석한 사례가 없었다. 따라서 본 연구는 딱지꽃의 뿌리를 다양한 용매별로 추출하고 주요한 물 질을 분리정제 하였다. 분리 정제된 물질을 \( \mathrm{NMR} \) 과 mass 분석 을 통하여 물질을 동정하였고 그 결과 주요성분이 화합물 (1) 임을 확인하였다. 또한, 동정된 물질의 산업적 응용을 위헤 딱 지꽃 뿌리에시 용매별로 화합물 (1) 추출양을 정량하였다.</p>	[ "딱지꽃 뿌리를 여러 용매로 추출하고 분리정제한 물질을 \\( \\mathrm{NMR} \\) 과 mass 분석을 통해 분리동정한 결과, 주요 물질이 2,3,8-Tri- \\( O \\)-methylellagic acid임이 확인됐다. 또한 2,3,8-Tri- \\( O \\)-methylellagic acid의 추출량을 정량함에 따라 최적의 추출용매가 메탄올임을 알아냈다." ]
55e-0c9-829a04ed-f1d3-4bff-b0d4-b93b9759ffff_00	생명LA	Sprague-Dawley 랫드를 이용한 신이 추출물의 \( 4 \)주 반복 용량 결정 독성시험	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>신이추출물 제조</h2> <p>신이는 목련과 및 그 밖의 동속 근연 식물의 꽃봉오리를 말하는 것으로 본 실험에 사용한 신이추출물은 (주)뉴온에서 제공받아 사용하였다. 실험에 사용한 신이는 중국 사천성에서 수확하여 건조한 목련(Magnolia kobus) 꽃봉오리를 사용하였으며 추출물은 Shaanxi Jiahe Phytochem Co., Ltd. (Shaanxi, China)에서 제조하였다. 추출물은 목련 꽃봉오리를 약 \(8 \)배 중량의 \(95 \) \( { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 물로 \(2 \)시간씩 \(3 \)회 추출한 후, \( 70 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 조건에서 농축 후, 분무건조를 거쳐 획득하여 사용하였다.</p> <h2>시험물질의 조제 및 투여</h2> <p>시험물질로 사용되는 신이 추출물(Magnoliae Flos extract, ME)은 중량 그대로를 순도 보정 없이 조제에 사용하였다. 정량의 시험물질을 전자저울을 이용하여 칭량하였고 부형제는 대한약품공업의 대한멸균증류수 주사용수를 사용하였다. 조제용기에 시험물질을 넣고 부형제를 소량씩 가하여 교반기를 이용하여 시험물질을 완전히 용해시킨 후 규정농도에 맞게 남은 부형제를 넣고 조제하였다. 조제물은 투여 당일에 매일 조제하여 투여에 사용하였다. 신이 추출물을 균일하게 용해시켜 일반적인 경구투여 반복독성 한계용량으로 사용되는 \( 1,000 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \) 보다 \(3 \)배 높은 \( 3,000 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \)을 최고용량으로 설정하고 또 다른 농도는 \(2 \)배수 간격을 두어 \( 1,500 \mathrm { mg } / \mathrm { kg } \)로 투여 농도를 설정하였다. 투여액량은 \( 10 \mathrm { ~mL } / \mathrm { kg } \)으로 하고 동물의 체중을 기준으로 개체 별 투여량을 산출하였다. 투여는 존데를 부착한 일회용 주사기를 이용하여 위내 강제 투여하였고, 신이 추출물은 투여 기간 동안 냉장보관 하였으며, 투여횟수 및 기간은 \(1 \)회/일, \(6 \)일/주, \(4 \)주간 진행하였다.</p> <h2>실험동물</h2> <p>실험동물은 \(6 \)주령의 암, 수컷 SD rat를 (주)오리엔트바이오에서 구입하였다. 실험동물 입수 시, 외관검사를 실시하고 전자저울로 체중을 측정하였다. \(1 \)주일간 실험실에서 순화과정을 거치고 그 기간 중에 일반증상을 관찰하여 이상이 없는 실험동물을 선택하여 실험에 사용하였다. 모든 실험동물은 군당 \(5 \)마리씩 배치하였다.</p> <h2>사육환경</h2> <p>실험기간 중 사육실 환경조건은 실내온도 \( 22 \pm 3 ^ {\circ } \mathrm { C } \), 상대습도 \( 50 \pm 20 \% \), 환기횟수 \( 15 \)~ \(20 \)회/시간, 명암주기 \(12 \)시간(오전 \(7 \)시~오후 \(7 \)시 및 조도 \(150 \)~ \(300 \) \( \mathrm { Lux } \), 소음 \( 60 \mathrm { ~dB } \) 이하를 유지하였으며 모든 실험동물은 Polysulfone 사육상자 \( (300 \mathrm { D } \times 500 \mathrm { ~W } \times \) \( 200 \mathrm { H } \mathrm { mm } \) )에 \(2 \)~ \(3 \)마리씩 분리하여 사육하였다. 동물실험은 국제실험동물관리평가인증협회(AAALAC- \(1 \))에 완전인증을 받은 (재)경기도경제과학진흥원 바이오센터에서 동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC)의 승인(승인번호: \(2021 \)- \(05 \)- \(0001 \))하에 시험기관의 표준작업순서에 따라 수행하였다.</p>	[ "본 연구에서는 목련과 및 그 밖의 동속 근연 식물의 꽃봉오리인 신이를 사용한 추출물을 실험에 사용하였다. 추출과정은 목련 꽃봉오리를 물로 3회 추출한 후 농축 및 분무건조하여 얻은 추출물을 사용하였다. 실험에서는 신이 추출물을 최고용량으로 설정한 후 다른 농도는 일정한 간격으로 설정하였다. 실험에는 6주령의 암 수컷 SD rat를 사용하였고, 동물실험은 AAALAC-1에 인증된 기관의 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 표준작업순서에 따라 수행되었다." ]
55e-0c9-829a04ed-f1d3-4bff-b0d4-b93b9759ffff_01	생명LA	Sprague-Dawley 랫드를 이용한 신이 추출물의 \( 4 \)주 반복 용량 결정 독성시험	<h2>사료 및 물의 급여방법</h2> <p>실험동물용 고형사료(Teklad Certified Irradiated Global \( 18 \% \) Protin Rodent Diet \(2918 \)C, Research Diet INC., New Brunswick, NJ, USA)는 두열바이오텍에서 공급받아 급이기에 넣고 자유섭취 하였다. 음수는 음용 상수도수를 정수시킨 후 폴리카보네이트제 물병에 넣고 멸균하여 자유섭취 하였다. 사료와 음수의 분석은 생산자로부터 공급된 성적서 및 국가공인 검사기관에서 검사한 자료를 참고하여 분석결과가 시험기관에서 정한 허용범위내에 속하는지를 확인하였다.</p> <h2>일반증상관찰, 체중 및 사료섭취량 측정</h2> <p>시험기간 중, 모든 동물에 대하여 투여 전 \( \cdot \)후 매일 \(2 \)회 일반증상의 변화 및 독성증상을 관찰하였다. 체중 측정은 군 분리 시, 투여기간 중 주 \(2 \)회 측정 및 부검 당일에 측정하였다. 사료섭취량은 투여 개시 후 \(4 \)주 동안 주 \(2 \)회 측정하였으며, 평균 사료섭취량은 사료를 급여한 후 섭취량 차이를 \(1 \)마리/ \(1 \)일 기준으로 산출하였다.</p> <h2>혈구분석</h2> <p>시험 종료 후 생존한 모든 동물을 대상으로 부검 전일 음수는 자유섭취 시키면서 절식을 진행하였다. 실험동물은 흡입마취제를 이용하여 호흡 마취 후, 개복하여 복대 동맥에서 혈액을 채혈하여 항응고제인 EDTA가 들어있는 채혈튜브(BD Caribe, Ltd., Franklin Lakes, NJ, USA)에 넣어 혈구분석기(MEK- \(6550 \) , NIHON KOHDEN, Tokyo, Japan)를 이용하여 White blood cell count (WBC), Red blood cell count (RBC), hemoglobin concentration (HGB), Hematocrit (HCT), Mean corpuscular hemoglobin (MCV), Mean corpuscular hemoglobin (MCH), Mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), Platelet (PLT), Red cell distribution width (RDW), Platelet distribution width (PDW), Mean platelet volume (MPV)를 측정하였다.</p> <h2>혈액생화학분석</h2> <p>혈구분석을 완료한 실험동물의 혈액을 \( 3,000 \mathrm { rpm } , 15 \)분간 원심분리기(Centrifuge \(5415 \)R, EPPENDORF, Hamburg, Germany)를 이용하여 원심 분리하여 얻은 혈청을 혈액생화학분석기(7020, HITACHI, Tokyo, Japan)를 이용하여 Glucose (GLU), Creatinine (CREA), Total protein (TP), Albumin (ALB), Glutamate oxaloacetate transaminase (GOT), Glutamate pyruvate transaminase (GPT), Total bilirubin (T-BIL), Cholesterol CHO, Triglyceride (TG), High density lipoprotein (HDL), Blood urea nitrogen (BUN), Low density lipoprotein (LDL), Inorganic phosphorous (IP), Lactate dehydrogenase (LDH), Direct bilirubin (D-BIL), Uric acid (UA)를 측정하였다.</p> <h2>부검소견 관찰 및 장기무게 측정</h2> <p>채혈 후 복대정맥을 절단하여 방혈하는 방법으로 도살을 실시하고, 부검소견을 관찰하였다. 부검 후 심장, 폐, 간, 비장, 신장,고환 및 난소를 적출하여 무게를 측정 후 부검 전 절식된 체중과 비교하여 상대적 장기중량을 산출하였다.</p> <h2>통계 처리</h2> <p>본 시험에서 얻은 결과는 평균 \( \pm \)표준편차로 나타냈으며, 대조군과 시험물질 투여군의 통계학적 유의성을 Student's t-test를 실행하여 \( p<0.05, p<0.01, p<0.001 \) 수준에서 검정하였다.</p>	[ "실험동물은 고형사료(Teklad Certified Irradiated Global \\( 18 \\% \\) Protin Rodent Diet \\(2918 \\)C)를 자유섭취하였다. 실험 종료 후 생존 동물은 음수를 자유섭취하면서 절식을 진행하였고, 도살 후 부검소견을 관찰하였다. 통계학적 결과는 평균 ± 표준편차로 표현되었고, 시험물질 투여군과 대조군 간 유의성은 Student's t-test를 통해 \\( p<0. 05, p<0. 01, p<0. 001 \\) 수준에서 검증하였다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-35d8-4cbe-a0e1-baa7104a21fa_05	생명LA	맥문동탕 용매 분획물의 UV에 의한 피부손상 개선 효능평가	<p>세포를 이용한 항산화 활성 검증은 \( \mathrm { ROS } - \mathrm { Glo } ^ {\mathrm { TM } } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) assay kit로 측정하였으며 앞서 \( \mathrm { DPPH } , \mathrm { ABTS } \) radical 소거능에서 가장 저해효과가 우수한 \( \mathrm { MW } - \mathrm { EA } \) 를 처리하여 확인하였다. 또한 세포 실험을 위해 CCD-986sk cell에서 시료의 세포 독성을 검증하였고, 그 결과 \( 6.25,12.5,25,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다(Fig. 2C). 따라서 6.25-100 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \)의 농도에서 \( \mathrm { ROS } \) 저해활성을 검증하였으며 그 결과 50,100 \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도에서 약 \( 17,34 \% \) 의 억제활성을 확인하였다(Fig.2D). 이는 MW-EA가 UV에 의해 증가된 \( \mathrm { ROS } \) 를 잠재적으로 억제 할 수 있음을 나타낸다.</p> <h2>주름 억제</h2> <p>맥문동탕의 주름억제 효능을 검증하기 위해 elastase 억제활성을 측정하였다. 시료는 MW-H, MW-EA, MW-B, MW-W로 측정하였으며 \( \mathrm { MW } - \mathrm { EA } \) 가 \( 10,100,1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도에서 10 , \( 21,43 \% \) 의 효과로 가장 우수한 저해효과를 나타내었다(Fig.3A). 기존 연구에서는 운지버섯 자실체 열수추출물이 \( 100 \mu \mathrm { g } \) \( \mathrm { mL } \) 에서 \( 18.6 \% \) 의 저해활성을 보여주었다.</p> <p>Elastase 억제활성 측정에서 가장 우수한 MW-EA를 이용해서 procollagen type-I C peptide 생성량 확인 및 광노화 유도 인자인 MMPS에 대해서 western blot을 실시하였다. Procollagen은 collagen의 전구체이고 이것을 측정하기 위해 \( \mathrm { c } \)-말단을 인지하는 항체를 이용하여 생성량을 측정하는 방법으로 확인하였다. CCD-986sk cell을 이용하여 MW-EA를 \( 6.25,12.5,25,50 \), \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도로 처리하였고 아무처리도 하지 않은 대조군과 비교하였을 때 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 87.8 \% \) 의 합성율을 보여주었다(Fig. 3B).</p>	[ "MW-EA는 ROS 저해활성, elastase 억제활성, procollagen type-I C peptide 생성량 확인 및 MMP-9 억제효과가 있는 것으로 나타났다. 6.25-100 \\(\\mu\\mathrm{g}/\\mathrm{ml}\\)의 농도에서 ROS 저해활성을 검증하였고 50,100 \\(\\mu\\mathrm{g}/\\mathrm{ml}\\)의 농도에서 17,34 %의 억제활성을 확인하였다. 10,100,1000 \\(\\mu\\mathrm{g}/\\mathrm{ml}\\)의 농도에서 10,21,43 %의 억제효과를 보여주었고, 100 \\(\\mu\\mathrm{g}/\\mathrm{ml}\\)에서 87.8 %의 합성율을 나타냈다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-35d8-4cbe-a0e1-baa7104a21fa_06	생명LA	맥문동탕 용매 분획물의 UV에 의한 피부손상 개선 효능평가	<p>CCD-986sk cell에 MW-EA를 처리하여 주름 형성에 작용하는 것으로 알려진 MMP-1, -2, -9, -13에 대한 단백질의 발현을 확인하였다. \( \mathrm { MW } - \mathrm { EA } \) 는 \( 6.25,12.5,25,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도로 처리하였고 최고 농도인 \( 100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( \mathrm { MMP } -1,-2,-9 \), - 13 의 순서로 \( 88,49,56,66 \% \) 의 억제효과를 보여주었다(Fig.4A-D). 기존 연구에서는 참깨 에탄올 추출물이 동일한 농도에서 MMP-1 protein의 발현을 약 \( 40 \% \) 억제하였다는 보고가 있다. 이 결과들을 통해 MW-EA의 주름 억제 효능을 예측할 수 있었다.</p> <h2>미백 활성</h2> <p>맥문동탕의 미백 효과는 tyrosinase 억제활성과 western blot을 통해 미백관련 인자의 발현 확인으로 검증하였다. 맥문동탕 분획물의 tyrosinase 저해효과는 MW-EA, MW-H, MW-B, MW- \( \mathrm { W } \) 의 순서로 우수하였으며 \( 1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도에서 각 각 65 , \( 23,13,9 \% \) 로 나타났다(Fig. 5). 기존 보고된 연구에서는 양제근 에탄올 추출물이 동일한 농도에서 \( 78 \%[28] \), 육종용 추출물은 \( 2,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 68 \% \) 의 저해 활성을 보여주었다.</p> <p>Western blot을 통해 미백 인자인 MITF, tyrosinase, TRP-1, \( \mathrm { TRP } -2 \) 를 확인하였다. 미백관련 인자의 발현을 확인하기에 앞서 \( \mathrm { HEM } \) cell에서 \( \mathrm { MW } - \mathrm { EA } \) 의 세포독성을 검증하였고 \( 6.25,12.5 \), \( 25,50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았다(Fig. 6A). MITF, tyrosinase, TRP-1, TRP-2에 대한 저해 효과는 \( 50 \mu \mathrm { g } \) / \( \mathrm { mL } \) 의 농도에서 각 각 \( 10,25,6,12 \% \) 로 나타났다(Fig. 6B-E). 반면에 도인승기탕은 동일한 농도에서 MITF는 \( 20 \% \), tyrosinase는 \( 13 \% \), TRP-1은 \( 12 \% \), TRP-2는 \( 15 \% \) 의 억제효과를 보여주었다. 이 결과들을 통해 MW-EA의 미백 활성을 확인하였다.</p> <p>본 연구를 통해 맥문동탕의 피부개선효과를 검증함으로써 한방 처방을 이용한 피부개선 천연 소재의 개발 가능성을 확인하였다.</p> <h1>초 록</h1> <p>맥문동탕 열수추출물의 용매분획물을 이용하여 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl radical scavenge, 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical scavenge, elastase, tyrosinase 억제 효과를 검증하였고 그 결과 에틸아세테이트 분획물(MW-EA)에서 가장 우수한 저해활성을 보여주었다. 세포를 이용한 활성 검증에 서는 \( \mathrm { MW } - \mathrm { EA } \) 를 처리하였을 때 \( \mathrm { ROS } \) 저해활성에서 \( 34 \%(100 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ), \mathrm { MMPs } \) 저해 \( 50 \%(100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 이상, 미백 활성에서는 tyrosinase를 \( 25 \%(50 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 억제하는 것을 확인 하였다. 따라서 맥문동탕은 피부개선 소재로서 개발 가능성이 높다고 사료된다.</p>	[ "본 연구에서는 맥문동탕(MW-EA)이 피부에 미치는 효과를 조사하였다. 기존 연구에서 참깨 에탄올 추출물이 MMP-1 protein의 발현을 약 \\(40\\%\\) 억제한 것을 바탕으로, MW-EA의 주름 억제 효능을 예상할 수 있었다. 세포 실험을 통해 MW-EA가 ROS를 \\(34\\%\\) (100 \\(\\mu g/mL\\)), MMPs를 \\(50\\%\\) (100 \\(\\mu g/mL\\)) 억제하며, 미백 활성에서 tyrosinase를 \\(25\\%\\) (50 \\(\\mu g/mL\\)) 억제함을 확인하였다. 또한, 맥문동탕의 미백 효과는 tyrosinase 억제 활성과 western blot을 이용하여 미백 관련 인자의 발현을 검증하였다. 이로써 한방 처방을 활용한 피부 개선을 위한 천연 소재 개발의 가능성을 확인하였다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-35d8-4cbe-a0e1-baa7104a21fa_02	생명LA	맥문동탕 용매 분획물의 UV에 의한 피부손상 개선 효능평가	<h2>HPLC 분석</h2> <p>맥문동탕 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물(MW-EA)이 포함하고 있는 hesperidin과 narirutin의 함량을 확인하기 위해 Table 1의 조건에서 분석을 수행하였다. HPLC 분석에 사용된 칼럼 및 장비는 YMC Triart \( \mathrm { C } 18(4.6 \times 250 \mathrm { ~mm } \), I.D. \( 5 \mu \mathrm { m } \), YMC Co., Ltd., Kyoto, Japan)과 Agilent 1260 Infinity(Agilent, Folsom, CA, USA)를 사용하였다. 시료의 standard 물질 함량에 대한 분석은 '의약품 등 분석법 의 벨리데이션 가이드라인(식품의약품안전처)'을 참고하여 수행하였다.</p> <h2>세포 배양</h2> <p>세포 배양은 DMEM/high glucose (10 \% FBS, \( 1 \% \) penicillin/streptomycin 첨가) 배지와 HEM glowth medium \( (0.68 \% \) Freezing medium, 1 \% penicillin/streptomycin 첨가) 배지를 사용하여 CCD-986sk cell과 \( \mathrm { HEM } \) cell을 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다.</p> <h2>MTT assay에 의한 세포 독성 측정</h2> <p>시료의 세포 독성을 확인하기 위해 96 well plate에 CCD- \( 986 \mathrm { sk } \) 와 \( \mathrm { HEM } \) 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 4 } , 3 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { cells } / \mathrm { well } \) 로 분주하고 24 시간동안 안정화시켰다. 그 후 시료를 농도별로 처리하고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \), \( 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 의 조건으로 incubator에서 48 시간 동안 배양하였다. \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) 의 MTT 시약을 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>항산화 활성 측정</h2> <p>항산화 활성 검증은 \( \mathrm { DPPH } \) radical scavenging[18]과 \( \mathrm { ABTS } \) radical scavenging[19] 그리고 \( \mathrm { ROS } _ {\mathrm { G } } \mathrm { Glo } ^ {\mathrm { TM } } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) assay kit를 사용하여 측정하였다. \( \mathrm { ROS } \) 생성량 측정의 경우 96 well plate에 CCD-986sk cell을 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well의 양으로 분주하여 시료를 처리하고 \( \mathrm { ROS } \) 발생양을 microplate reader로 측정하였다.</p>	[ "맥문동탕 열수추출물의 에틸아세테이트 분획물(MW-EA)의 hesperidin과 narirutin 함량을 확인하기 위해 HPLC 분석을 YMC Triart C18, Agilent 1260 Infinity 장비로 수행하였다. CCD-986sk cell과 HEM glowth medium 배지를 \\( 37 ^ {\\circ } \\mathrm { C } , 5 \\% \\mathrm { CO } _ { 2 } \\) incubator에서 배양하고 MTT assay를 사용하여 시료의 세포 독성을 측정하였다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-35d8-4cbe-a0e1-baa7104a21fa_04	생명LA	맥문동탕 용매 분획물의 UV에 의한 피부손상 개선 효능평가	<h2>통계처리</h2> <p>SPSS \( 10.0 \) 으로 통계처리 하였으며, \( t \)-test를 통해 유의수준 \( p< \) \( 0.05 \) 에서 분산분석(ANOVA: analysis of variance)으로 검증하였다.</p> <h1>결과 및 고찰</h1> <h2>HPLC 분석</h2> <p>MW-EA에 포함되어 있는 지표성분 hesperidin과 narirutin의 함량을 분석한 결과 Table 2, 3과 같다. Standard 물질을 이용한 calibration curve를 통해 hesperidin은 MW-EA \( 1,000 \mu \mathrm { g } \) 당 \( 16.480 \pm 0.636 \mu \mathrm { g } \) 을 포함하고 있고, narirutin의 경우 \( 12.535 \pm \) \( 0.301 \mu \mathrm { g } \) 을 포함하는 것을 알 수 있었다. 또한 standard 물질과 시료의 chromatogram을 확인한 결과 Fig. 1과 같았다. 본 연구에서는 지표성분(hesperidin, narirutin)의 함량과 성분 profile pathern이 확인된 MW-EA를 주요 시험 시료로 이용하였다.</p> <h2>항산화 활성</h2> <p>DPPH, ABTS radical 소거능 측정과 ROS-Glo \( { } ^ {\mathrm { TM } } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) assay kit를 이용한 ROS 생성량 측정을 통해서 맥문동탕 열수추출물의 헥산(MW-H), 에틸아세테이트(MW-EA), 부탄올(MW-B), 물(MW-W) 분획물의 항산화 효과를 확인하였다. DPPH radical 소거능 측정에서 MW-EA가 가장 우수한 효과를 나타냈는데 \( 100,1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도에서 각각 \( 76,96 \% \) 로 확인되었다(Fig.2A). 기존연구에서는 잘피 물추출물이 \( 1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 \( 87.64 \% \), 겉보리에서 배양한 영지버섯 추출물은 동일 농도에서 약 \( 10 \%[23] \) 의 저해율을 보여주었다.</p> <p>ABTS radical 소거능에서는 MW-EA, MW-B, MW-W, MW- \( \mathrm { H } \) 의 순서로 저해활성이 높았으며 MW-EA의 경우 \( 100,1,000 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 각각 \( 92,96 \% \) 의 억제효과를 보여주었다(Fig. 2B). 반면에 이슬송이버섯의 물추출물은 \( 1,250 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 약 \( 20 \% \) , 유자과즙 물추출물의 경우 \( 1,000 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 에서 약 \( 10 \%[25] \)의 저해효과가 보고되었다.</p>	[ "통계처리 소프트웨어 SPSS 10.0을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 진행하였고, 유의수준 \\( p< 0.05 \\) 에서 검증하였다. MW-EA의 지표성분 hesperidin과 narirutin의 함량은 Table 2, 3에 나타나 있다. DPPH, ABTS 방식으로 산화 활성 제거 능력을 측정하였으며, ROS-Glo \\( { } ^ {\\mathrm { TM } } \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { O } _ { 2 } \\) assay kit을 이용하여 ROS 생성량을 측정함으로써 맥문동탕 열수추출물의 분획물 MW-H, MW-EA, MW-B, MW-W의 항산화 효과를 확인하였다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-35d8-4cbe-a0e1-baa7104a21fa_01	생명LA	맥문동탕 용매 분획물의 UV에 의한 피부손상 개선 효능평가	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>재료 및 시약</h2> <p>본 연구에서 사용한 효능 측정 시약은 n-succinyl-(L-Ala) \( { } _ { 3 } \)-p-nitroanilide, collagenase from Clostridium histolyticum, potassium persulfate, L-ascorbic acid, L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA), 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH), 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), 3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT)를 Sigma chemical Co. (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 맥문동탕의 구성약재는 2016년 2월 (주)휴먼허브(Gyeongsan-si, Korea)에서 구입하여 실험에 사용하였다. 지표성분의 경우 hesperidin(Sigma)에서 구입하였으며 narirutin은 한약진흥재단 천연물 물질은행에서 분양받아서 사용하였다. 세포 배양을 위한 시약으로는 penicillin/streptomycin, fetal bovine serum (FBS), dulbecco's modified eagle medium (DMEM)을 gibco BRL Co. (Grand Island, New York, USA)에서 구입하였으며, 주름억제 활성 측정을 위한 시약으로 위한 human tumor necrosis factor- \( \alpha \) with carrier, sterile \( ( \mathrm { TNF } - \alpha) \) 를 Cell Signaling사(Danvers, MA, USA)에서 구입하였고, 미백활성 검증에는 forskolin (Sigma)을 사용하였다. Primary antibody 및 secondary antibody는 Santa cruz biotechnology Inc. (Santa cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 주름 개선활성 측정을 위해 procollagen type I C-peptide kit (Takara Shuzo, Kyoto, Japan), 항산화활성 측정은 ROS-Glo \( ^ {\mathrm { TM } } \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) assay kit (Promega, Madison, WI, USA)를 구입하였다.</p> <h2>시료 추출 및 용매 분획</h2> <p>맥문동탕 시료 제조는 맥문동(來門冬) \( 8 \mathrm { ~g } \), 진피(陳皮), 반하(龵夏), 백출(白尤), 복령(茯苓), 소맥(小來)을 각각 \( 4 \mathrm { ~g } \), 인삼(人䒧), 감초(甘草), 생강(牛盢)을 각각 \( 2 \mathrm { ~g } \), 오매(烏梅) 1개 준비하는 것을 1회 분량으로 하였다. 여기에 10 배의 물을 넣고 3시간씩 추출하는 방법으로 3회 반복하였다. 이 방법으로 3회 추출하고 \( (111 \mathrm { ~g } ) \) 시료 \( 37.28 \mathrm { ~g } \) 을 얻었으며 수율은 \( 33.6 \% \) 로 확인되었다. 확보된 추출물 중 \( 10 \mathrm { ~g } \) 으로 용매분획법을 통해 n-hexane \( (0.35 \) \( \mathrm { g } ) \), ethyl acetate \( (0.29 \mathrm { ~g } ) \), butanol (1.42 g) water (7.74 \( \mathrm { g } ) \) 분획물을 확보하였다.</p>	[ "맥문동탕의 구성약재는 (주)휴먼허브에서 구입하여 사용하였으며, 맥문동, 진피, 반하, 백출, 복령, 소맥 등 다양한 약재를 이용하여 제조하였다. 특정 양의 약재와 10 배의 물을 섞어 3시간 동안 추출하는 과정을 3회 반복하여 추출물을 확보하였고, 확보된 추출물 중 \\(10 \\mathrm{~g}\\)를 이용하여 n-hexane, ethyl acetate, butanol, water 등의 분획물을 만들었다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-35d8-4cbe-a0e1-baa7104a21fa_00	생명LA	맥문동탕 용매 분획물의 UV에 의한 피부손상 개선 효능평가	<h1>서 론</h1> <p>자외선(UV)은 피부에 많은 영향을 미치는데 염증, 피부암 및 피부 노화(광노화)를 유발할 수 있다. 임상에서 노화로 인한 피부는 미세하고 거친 주름, 색소 침착 및 모세 혈관 확장등으로 확인할 수 있고, 생물학적으로 봤을 때는 콜라겐 발현을 억제하는 것을 특징적인 것으로 볼 수 있다. UV에 의한 노화의 경우 프로콜라겐 합성 감소 및 콜라겐의 분해 등으로 인해 노화가 일어난다.</p> <p>UV에 의해 유발되는 피부노화는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 인한 세포막 손상으로 최종적으로는 피부세포의 기능을 상실하여 주름을 야기시킨다. 그리고 콜라겐과 matrix metalloproteinase (MMP) expression의 기본 메커니즘을 확인하는 것 또한 중요한데, 이에 대한 피부의 초기 반응 중 하나는 epidermal growth factor receptor와 tumor necrosis factor(TNF)- \( \alpha \) receptor와 같은 세포 표면에 발현되는 성장 인자 및 사이토카인 수용체의 활성화를 들 수 있다.</p> <p>또한, UV는 mitogen-activated protein kinases의 활성화를 유도하여 AP-1의 발현을 증가시키며 차례로 MMPs의 상향 조절을 유발한다. 증가되는 MMPs로는 MMP-1, MMP-2, MMP-9, MMP-13 등이 있으며 이것은 진피의 extracellular matrix(ECM) protein 분해를 야기시킨다[6]. ECM은 피부 탄력성과 수분 수용력을 유지하는 기능을 하므로 이것의 기능저하는 주름을 유발한다.</p> <p>\( \mathrm { UV } \) 는 피부의 melanin 합성과도 관련되어 있는데 melanin은 tyrosinase를 가지고 있는 melanosome 내에서 합성된다. Melanin합성에 관여하는 특이적 효소로는 tyrosinase, tyrosinase-related protein (TRP)-1 및 TRP-2가 있으며, tyrosinase는 3,4-dihydroxy-phenylalanine (DOPA)을 형성하는 tyrosine의 hydroxylation을 촉매하고 DOPA를 산화시켜 DOPA quinone을 생성시키는 melanin 생성 속도 제한 효소로 작용한다. TRP-1과 TRP-2는 tyrosinase의 downstream에서 melanin 합성에 관여하며, 이 특이적 효소는 microphthalmia-associated transcription factor에 의해서 조절되어 최종적으로 melanin 합성에 관여하는 역할을 한다. Melanin은 피부와 모발의 색을 담당하고 자외선 차단에 있어서 중요한 역할을 하기도 하지만, 표피의 melanin 합성이 증가하게 되면 피부가 어두워지고 미용상 문제가 발생할 수 있다.</p> <p>맥문동탕은 맥문동(麥門冬), 진피(陳皮), 반하(龵夏), 백출(白尤), 복령(茯苓), 소맥(小來), 인삼(人參), 감초(甘草), 오매(烏梅), 생강(牛䓊) 총 10 가지 약재로 구성되어 있으며, 보고된 연구결과로는 폐활량 개선에 미치는 영향[13], 알레르기 천식[14], 호흡기점액 생성 및 분비[15], 항암 및 항전이 효능[16] 등이 있는데, 항산화, 주름억제, 미백효과 등에 대한 연구는 진행된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 맥문동탕의 신규 적응증 발굴을 위해 항산화, 주름억제, 미백효과에 대한 활성을 용매 분획물을 이용하여 검증하였다.</p>	[ "자외선(UV)은 피부에 큰 영향을 미치며, 염증, 피부암, 피부 노화 등을 유발할 수 있다. 피부 노화는 임상적으로는 주름, 색소 침착, 모세혈관 확장 등으로 확인될 수 있으며, 생물학적으로는 콜라겐 발현의 억제로 특징짓는다. UV는 피부의 melanin 합성과도 관련이 있으며, melanin은 tyrosinase를 포함하는 melanosome에서 합성된다. 이는 TRP-1과 TRP-2에 의해 조절되며, 이들은 tyrosinase의 downstream에서 melanin 합성에 관여한다. Melanin은 피부와 모발의 색을 결정하며, 자외선 차단에 중요한 역할을 한다. 그러나 표피에서의 melanin 합성이 증가하면 피부가 어두워져 미용상의 문제가 발생할 수 있다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-35d8-4cbe-a0e1-baa7104a21fa_03	생명LA	맥문동탕 용매 분획물의 UV에 의한 피부손상 개선 효능평가	<h2>주름 억제 활성 측정</h2> <p>Elastase 저해활성은 다음과 같이 진행하였다. \( 40 \mu \mathrm { L } \) 의 시료를 96 well plate에 넣고 \( 50 \mathrm { mM } \) tris-HCl buffer \( ( \mathrm { pH } \) 8.6)로 기질과 효소를 녹인후 처리한다. 30분간 반응시킨 후 \( 445 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다. Procollagen type-I 생합성 측정은 96 well plate에 CCD-986sk cell을 \( 1 \times 10 ^ { 4 } \) cells/well로 분주하여 UV-B \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \) 와 TNF- \( \alpha(10 \mathrm { ng } / \mathrm { mL } ) \) 를 처리한 후 48 시간 배양하였다. 이것의 상등액을 취하여 propeptide의 양을 측정하였다.</p> <h2>미백 활성 측정</h2> <p>미백 활성은 mushroom tyrosinase \( (110 \mathrm { U } / \mathrm { mL } ) \) 를 사용하여 측정하였다. \( 0.175 \mathrm { M } \) sodium phosphate buffer \( ( \mathrm { pH } \quad 6.8) \) 로 10 \( \mathrm { mM } \) L-DOPA와 효소를 녹인후 각 반응구에 넣고 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 2 \( \min \) 간 반응시켜 \( 492 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p> <h2>Western blot을 통한 주름 및 미백 관련 단백질의 발현 측정</h2> <p>CCD-986sk, HEM cell을 6 well plate에 각각 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well, \( 3 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \mathrm { well } \) 로 분주하고 24 시간 동안 안정화시켰다. 그 후 UV-B \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ), \mathrm { TNF } - \alpha(10 \mathrm { ng } / \mathrm { mL } ) \) 또는 forskolin \( (1 \mathrm { nM } ) \)을 시료와 함께 48시간 동안 배양하였다. 처리된 세포를 lysis buffer로 모은후 bradford assay를 통해 정량하였으며 \( 10 \% \) SDS-PAGE로 전기영동 하였다. PVDF membrane에 transfer하는 과정과 primary \&secondary antibody를 반응시키는 것을 통해 결과를 측정하였다. 결과는 ImageQuant LAS-4000 (GE life sciences, Taipei, Taiwan)를 사용하여 수치화 하였다.</p>	[ "Elastase 저해활성은 시료를 tris-HCl 버퍼로 녹인 후, 30분간 반응시켜서 측정하였다. 반면, 미백 활성은 mushroom tyrosinase를 사용하고, 이를 sodium phosphate buffer로 녹인 후, 37도에서 2분간 반응시켜서 측정하였다. 이 두 가지 방법을 통해 각각의 활성을 확인하였다." ]
55e-0c9-59891423-b77a-401d-9835-ba6b710b4702_00	생명LA	천궁으로부터 lipid 의 분리 동정	<p>화합물 4는 positive FAB-MS 스펙트럼에서 분자이온피크가 \( m / z ~ 677 \)에서 관측되어 분자량을 \( 676 \mathrm { Da } \)로 결정하였다. IR 스펙트럼에서 수산기 \( \left (3343 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), ester \( \left (1732 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \) 및 olefin \((1456, ~1376 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \) )에서 유래한 흡수밴드가 확인되었다. NMR 스펙트럼을 보면 모두 33개의 탄소 signal 이 관측되었고, 각 signal의 chemical shift로부터 2분자의 hexose와 18개로 이루어진 1분자의 지방산과 1분자의 glycerol로 이루어진 diglycosyl monoglyceride로 확인되었다. \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } \)-NMR 스펙트럼에서 당부에서 유래한 signal의 chemical shift로부터 말단 \( \alpha \)-D-galactopyranosyl의 존재가 확인되었다 \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~100.69, ~ \mathrm { C } -1 ^ {\prime \prime } ; ~70.38,~ \mathrm { C } -2 ^ {\prime \prime } ;~ 71.61 \right . \), \( \left . \mathrm { C } ^ {\prime 3 } 3 ^ {\prime \prime } , ~71.21,~ \mathrm { C } -4 ^ {\prime \prime } ,~ 72.72,~ \mathrm { C } -5 ^ {\prime \prime } ,~ 62.89,~ \mathrm { C } -6 ^ {\prime \prime } \right ) \). 또 다른 당에서 유래한 탄소 signal의 chemical shift를 보면, 1개의 hemiacetal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~ 105.47,~ \mathrm { C } -1 ' \right ), 4 \)개의 oxygenated-methine \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~ 72.67,~ \mathrm { C } -2 ^ {\prime } \right . \); \( 74.82, ~ \mathrm { C } -3 ^ {\prime } ; ~70.27,~ \mathrm { C } -4 ^ {\prime } ;~ 74.72,~ \mathrm { C } -5 ^ {\prime } \))은 \( \beta \)-D-galactopyranose의 것과 같았으나, 1개의 oxygenated-methylene 탄소 signal의 chemical shift는 보통의 값인 \( \delta_ {\mathrm { C } } ~ 62 \)보다 저자장으로 이동되어 \( \delta_ {\mathrm { C } } ~ 67.93 \)으로 나타났다. 이는 \( \beta \)-D-galactopyranose의 6번 수산기에 다른 당이 결합하여 glycosidation 효과에 의해 저자장으로 이동된 것으로 확인되었다. 따라서 당부의 부분 구조는 \( \alpha \)-Dgalactopyranosyl (1 \( \rightarrow \)6)- \( \beta \)-D-galactopyranose로 동정되었다. 지방산의 경우 NMR signal을 보면 한개의 ester 탄소 \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . ~175.63 \), \( \mathrm { C } -1) \) 6개의 olefin methine \( ( \delta_ {\mathrm { C } } ~132.88,~ \mathrm { C } -9 ;~ 128.40,~ \mathrm { C } -10 \); \(129.36,~ \mathrm { C } -12; ~129.35,~ \mathrm { C } -13;~ 129.01,~ \mathrm { C } -15;~ 131.24,~ \mathrm { C } -16 \)), 10개의 methylene \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~ 21.64-35.07, ~ \mathrm { C } -2 \sim 8,~ \mathrm { C } -11,~ \mathrm { C } -14, ~ \mathrm { C } - \right . 17 \)), 1개의 methyl \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~14.81, \mathrm { C } -18 \right ) \)이 관측되어 octadecatrienoic acid로 추정되었다. NMR data를 문헌값과 비교하여 linolenic acid로 동정되었다. Linolenic acid의 결합위치는 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \) NMR 스펙트럼에서 glycerol의 3번 oxygenated-methylene 수소 signal이 보통보다 저자장으로 이동된 \( \delta_ {\mathrm { H } } ~4.15 \)에서 관측된 점과, HMBC 스펙트럼에서 linolenic acid의 ester 탄소 signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } \right . ~ 175.63,~ \mathrm { C } -1) \)이 glycerol의 3번 oxygenated-methylene 수소 signal과 correlation을 보인 점으로부터 glycerol의 3번 수산기로 확인되었다. 당의 결합위치는 HMBC 스펙트럼에서 \( \beta \)-Dgalactopyranose의 anomer 탄소 및 수소 signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~105.47, \delta_ {\mathrm { H } } \right . 4.25 \))과 glycerol의 1번 수소 밋 탄소 signal \( \left ( \delta_ {\mathrm { H } } ~3.85,~3.65 \right . \), \( \delta_ {\mathrm { C } } ~72.25 \))과의 사이에 cross peak가 관측된 점으로부터 glycerol 의 1번 수산기로 확인되었다. 따라서 화합물 4는 1-linolenoyl3-( \( \alpha \)-D-galactopyranosyl (1 \( \rightarrow \)6)- \( \beta \)-D-galactopyranosyl) glycerol로 구조동정되었다.</p>	[ "화합물 4는 positive FAB-MS 스펙트럼에서 \\( m/z \\) 값이 677로 관측되어 분자량을 676 Da로 결정하였다. IR 스펙트럼에서는 수산기, ester, 및 olefin으로부터 유래한 흡수밴드가 확인되었다. NMR 스펙트럼에서는 총 33개의 탄소 신호가 관측되었으며, 이를 통해 2분자의 hexose와 18개의 탄소로 구성된 1분자의 지방산과 1분자의 glycerol로 이루어진 diglycosyl monoglyceride로 확인되었다. 따라서 화합물 4의 당부 구조는 \\( \\alpha \\)-D-galactopyranosyl(1\\( \\rightarrow \\)6)-\\( \\beta \\)-D-galactopyranose로 동정되었다. 또한, Linolenic acid의 결합위치는 \\( ^1\\mathrm{H} \\) NMR 스펙트럼에서 glycerol의 3번 oxygenated-methylene 수소 신호의 이동과 HMBC 스펙트럼에서 linolenic acid의 ester 탄소 신호와 glycerol의 3번 oxygenated-methylene 수소 신호 간의 상관관계를 통해 glycerol의 3번 수산기로 확인되었다." ]
55e-0c9-0f1e6c07-d76d-46a8-a9d3-57d5a96a0803_01	생명LA	천궁으로부터 lipid 의 분리 동정	<h2>Methyl linoleate \((1) \)</h2> <p>Colorless oil; TLC (silica gel) \( R f ~ 0.62, ~n \)-hexane-EtOAc \((8:1) \), (octadecyl silica gel) \( \mathrm { Rf } 0.38 \), acetone- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) \((7:1) \); IR (LiF plates) \( v_ {\max } ~2924,~2854,~1749,~1458,~1436 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } ; { } ^ { 13 } \mathrm { C } \)과 'H NMR 스펙트럼: Table \(1 \)과 \(2 \). EI-MS: \( \mathrm { m/z } \) \(294 \) \( \mathrm { [M] ^ + } \).</p> <h2>Linoleic acid \((2) \)</h2> <p>Colorless oil; TLC (silica gel) \( R f ~ 0.69, ~n \)-hexane-EtOAc \((1:1) \), (octadecyl silica gel) \( R f \quad 0.83 \), acetone- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) (3:1); IR (LiF plates) \( v_ {\max } ~2930,~1740,~1462,~1438 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } ; { } ^ { 13 } \mathrm { C } \)과 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \) NMR 스펙트럼: Table \(1 \)과 \(2 \). EI-MS: \( m / \mathrm { z } ~280 \left [ \mathrm { M } ] ^ { + } \right . \).</p> <h2>6-Linoleoyl- \( \alpha \)-D-glucopyranosyl \( \beta \)-D-fructofuranoside (3)</h2> <p>White powder; TLC (silica gel) \( Rf ~0.44, \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)-MeOH- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) (7:3:1), (octadecyl silica gel) \( R f ~ 0.45 \), MeOH- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) (5:1); IR (LiF plates) \( v_ {\max } ~ 3331,~2924,~2854,~1721,~1457,~1378 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \); \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } \)과 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \) NMR 스펙트럼: Table 1과 2. positive FAB-MS: \( m / z ~605~[ \mathrm { M } + \mathrm { H } ] ^ { + } \).</p> <h2>1-Linolenoyl-3- \( ( \alpha \)-D-galactopyranosyl (1 \( \rightarrow \) 6)- \( \beta \)-D-galactopyranosyl) glycerol (4)</h2> <p>White powder; TLC (silica gel) \( Rf ~0.43, \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)-MeOH- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \)(65:35:10), (octadecyl silica gel) \( Rf ~0.62 \), acetone- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) (5:1); IR (LiF plates) \( v_ {\max } ~3343,~2921,~1732,~1456,~1376 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } , { } ^ { 13 } \mathrm { C } \)과 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \) NMR 스펙트럼: Table 1과 2. positive FAB-MS: \( m / z \) \( 677~[ \mathrm { M } + \mathrm { H } ] ^ { + } \).</p> <h2>1-Linoleoyl-3-( \( \alpha \)-D-galactopyranosyl (1 \( \rightarrow \)6)- \( \beta \)-D-galactopyranosyl) glycerol (5)</h2> <p>White powder; TLC (silica gel) \(Rf~ 0.43 \), \( \mathrm { CHCl } _ { 3 } \)-MeOH- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) (65:35:10), (octadecyl silica gel) \( R f ~ 0.59 \), acetone- \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) (3:1); IR (LiF plates) \( v_ {\max } ~ 3347,~2923,~1732,~1648,~1377 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } ; { } ^ { 13 } \mathrm { C } \)과 \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \) NMR 스펙트럼: Table 1과 2. positive FAB-MS: \( m / z \) \( 679~[ \mathrm { M } + \mathrm { H } ] ^ { + } \).</p>	[ "Colorless oil; TLC (silica gel) \\( R f ~ 0.62, ~n \\)-hexane-EtOAc \\((8:1) \\), (octadecyl silica gel) \\( \\mathrm { Rf } 0.38 \\), acetone- \\( \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { O } \\) \\((7:1) \\); IR (LiF plates) \\( v_ {\\max } ~2924,~2854,~1749,~1458,~1436 \\mathrm { ~cm } ^ { -1 } ; { } ^ { 13 } \\mathrm { C } \\)과 'H NMR 스펙트럼: Table \\(1 \\)과 \\(2 \\).EI-MS: \\( \\mathrm { m/z } \\) \\(294 \\) \\( \\mathrm { [M] ^ + } \\)." ]
55e-0c9-59891423-b77a-401d-9835-ba6b710b4702_01	생명LA	천궁으로부터 lipid 의 분리 동정	<p>화합물 5는 positive FAB-MS 스펙트럼에서 분자이온피크가 \( m / z 679 \)에서 관측되어 분자량을 \( 678 \mathrm { Da } \)로 결정하였다. \( \mathrm { IR } \) 스펙트럼에서 수산기 \( \left (3347 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \), ester \( \left (1732 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \right ) \) 및 olefin \( (1648 \), \( 1377 \mathrm { ~cm } ^ { -1 } \) )에서 유래한 흡수밴드가 확인되었다. 화합물 5의 분자량이 화합물 4보다 \( 2 \mathrm { Da } \) 큰 점과, NMR 스펙트럼에서 지방산을 제외한 signal이 화합물 4와 유사한 점으로부터 화합물 5는 지방산 구조에서 화합물 4보다 이중결합이 한 개 적은 화합물로 추정되었다. 지방산의 경우 NMR signal을 보면 1개의 ester 탄소 \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~175.61,~ \mathrm { C } -1 \right ) 4 \)개의 olefin methine \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~131.02 \right .,~ \mathrm { C } -9; ~129.25,~ \mathrm { C } -10;~ 129.19,~ \mathrm { C } -12;~ 131.08,~ \mathrm { C } -13; \) \( \delta_ {\mathrm { H } } 5.36 \), \( \mathrm { H } -9 ; 5.32, \mathrm { H } -10 ; 5.32, \mathrm { H } -12 ; 5.36, \mathrm { H } -13 \)), \(12 \)개의 methylene \( \left ( \delta_ {\mathrm { C } } ~23.77-35.07, ~ \mathrm { C } -2 \sim 8, \mathrm { C } -11,~ \mathrm { C } -14 \sim 17 ;~ \delta_ {\mathrm { H } } ~1.30-2.78, ~ \mathrm { H } - \right . 2 \sim 8 , \mathrm { H } -11,~ \mathrm { H } -14 \sim17 \)), 1개의 methyl ( \(14.59, ~ \mathrm { C } -18;~ \delta_ {\mathrm { H } } 0.91 \), \( \mathrm { H } -18 \) ) 관측되어 octadecadienoic acid로 추정되었다. NMR data를 문헌값과 비교하여 linoleic acid로 동정되었다. 따라서 화합물 5는 1-linoleoyl-3-( \( \alpha \)-D-galactopyranosyl (1 \( \rightarrow \)6)- \( \beta \)-D-galactopyranosyl) glycerol로 구조동정되었다.</p> <p>Sucrose와 지방산이 결합한 화합물 3과 digalactosyl-mono-glyceride 구조를 갖는 화합물 4 및 5는 천연에서 매우 드물게 발견되는 화합물이다. 또한, 보고된 지질화합물들의 면역증강, 항암활성 등을 통해, 천궁 근경의 다양한 약리활성 소재로서의 가능성을 기대할 수 있다.</p>	[ "본 논문에서는 천연에서 매우 드물게 발견되는 화합물인 Sucrose와 지방산이 결합한 화합물 3, digalactosyl-mono-glyceride 구조를 갖는 화합물 4와 5의 대해 스펙트럼별 분석 결과와 구조 등을 글로 제시하였고, 다양한 의학적 특성을 통해 약리활성 소재로의 가능성을 제시하였다." ]
55e-0c9-0f1e6c07-d76d-46a8-a9d3-57d5a96a0803_00	생명LA	천궁으로부터 lipid 의 분리 동정	<h1>재료 및 방법</h1> <h2>시험 약재</h2> <p>본 실험에 사용한 천궁의 근경은 농촌진흥청 국립원예특작과학원 약용삭물과로부터 제공 받았으며, 정진태 연구사가 동정하였다. 표준 시료는 경희대학교 천연물화학실험실에 보관되어 있다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>칼럼크로마토그래피에 사용한 충진제는 silica gel (Kiesel gel \(60 \), Merck, Darmstadt, Germany), ocatdecyl silica gel (LiChroprep RP- \(18 \), \(40 \)- \(60 \) \( \mu \mathrm { m } \), Merck)과 Sephadex LH- \(20 \) (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)을 사용하였다. 박층크로마토그래피는 Kiesel gel \( 60 \mathrm { ~F } _ { 254 } \) 와 RP- \(18 \) \( \mathrm { F } _ { 254 { } ^ { S } } \) (Merck)를 사용하였으며, UV lamp (Spectroline Model ENF- \(240 \) C/F, Spectronics Corporation, Westbury, NY, USA)를 사용하여 검출하였으며, \( 10 \% \) 황산을 적신 후 가열하여 발색하였다. \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } \) NMR 과 \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } \) NMR 스펙트럼은 Bruker Avance 600 (Billerica, MA, USA)로, IR 스펙트럼은 Perkin Elmer Spectrum One FT-IR spectrometer (Buckinghamshire, England)로, 질량분석 스펙트럼은 JEOL JMSAX- \(700 \) mass spectrometer (Tokyo, Japan)로 측정하였다.</p> <h2>지질화합물의 분리</h2> <p>건조한 천궁 근경 분말 \( (10 \mathrm { ~kg } ) \)을 \( 70 \% \) ethanol (EtOH, \(54 \mathrm { ~L } \))로 실온에서 \(15 \)시간 \(2 \)회 반복 추출하였다. 추출액을 여과하고, 여액을 감압 농축하여 추출물 \( (2.1 \mathrm { ~kg } ) \)을 얻었다. 추출물에 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } \) \( (4 \mathrm { ~L } ) \)을 넣어 현탁한 후, EtOAc ( \(4 \mathrm { ~L } \times 3) \)와 \( n \)-BuOH (3.2 L \( \times \)3)로 분획하였다. 얻어진 분획을 감압농축하여 EtOAc 분획물(COE, \( 280 \mathrm { ~g } ), n- \mathrm { BuOH } \) 분획물(COB, \( 125 \mathrm { ~g } ) \) 및 물 분획물(COW, \( 1.695 \mathrm { ~kg } ) \)을 제조하였다. EtOAc 분획물( \( 270 \mathrm { ~g } ) \)과 \( n \) -BuOH 분획물( \( 120 \mathrm { ~g } ) \)에 대하여 silica gel, octadecyl silica gel 및 Sephadex LH- \(20 \)을 정지상으로 사용하여 칼럼크로마토그래피를 반복 수행한 결과 \(5 \)종의 지질화합물을 분리하였다.</p>	[ "이 연구에서는 천궁의 근경을 국립원예특작과학원 약용삭물과로부터 받아 정진태 연구사가 동정하였으며, 경희대학교 천연물화학실험실에 표준 시료를 보관하였다. 여러 충진제를 이용한 칼럼크로마토그래피를 이용하였으며, 박층크로마토그래피에서는 UV lamp를 이용해 검출하였다. 또한, EtOAc 분획물과 n-BuOH 분획물에 대해 칼럼크로마토그래피를 수행, 결과적으로 5종의 지질화합물을 성공적으로 분리하였다." ]
55e-0c9-4ed49a10-4c5a-4728-9465-791a07dc7c89_01	생명LA	자동화 HPLC/SPE/HPLC 시스템(Sepbox system) 을 활용한 고추 잎(leaf of Capsicum annuum L .) 추출물 분리 및 \( \alpha \)-glucosidase 억제활성 물질 탐색	<h1>결 과</h1> <h2>Sepbox chromatography 소분획 분석 및 \( \alpha \)-glucosidase inhibition activity</h2> <p>CP \( 1 \) \( 250 \mathrm { mg } \)을 Sepbox chromatography를 이용하여 \(20 \)시간 이내에 \(288 \)개의 소분획으로 분리하였으며, 일부 소분획물의 HPLC 크로마토그램은 Fig. \(1 \)에 나타내었다. Fig. \(1 \)에서 보이는 대로, Sepbox system을 통해 CP \( 1 \)을 \(1 \)- \(3 \)개의 화합물을 포함한 소분획으로 분리할 수 있었으며, 분리에 소모된 시간은 \(20 \)시간 이내였다. 소분획 중 단일물질 수준으로 분리가 된 것으로 예상되는 시료를 LC-MS을 통해 분석한 결과, UV흡수스펙트럼과 분자량 정보를 바탕으로 \(4 \)T- \(10 \)은 luteolin \(7 \)- \(O \)-( \(2 \)"- \(O \)-apiosyl) glucoside (L \(7 \)AG), \(4 \)T- \(11 \)은 luteolin \(7 \)- \(O \)-glucoside (L \(7 \)G), \(4 \)T- \(13 \)은 apigenin \(7 \)- \(O \)-( \(2 \)"- \(O \)-apiosyl)glucoside (A \(7 \)AG), \(4 \)T- \(07 \)은 luteolin \(7 \)- \(O \)-( \(2 \)"- \(O \)-apiosyl- \(O \)- \(6 \)"-malonyl)glucoside (L \(7 \)AMG), \(5 \)T- \(09 \)는 apigenin \(7 \)- \(O \)-glucoside (A \(7 \)G), \(3 \)T- \(11 \)은 apigenin \(7 \)- \( O \)-( \(2 \)"- \(O \)-apiosyl- \(O \)- \(6 \)"-malonyl)glucoside (A \(7 \)AMG)으로 추정되었다(Table \(3 \)).</p> <p>이후 각 소분획물의 \( \alpha \)-glucosidase inhibitory (AGI) activity를 측정하기 위해 농축 후, 각각을 \( \mathrm { DMSO } \)에 용해시켰다. AGI 활성 결과, \( 3 \mathrm { ~T } -13(23.13 \pm 7.61 \%) \), \(4 \mathrm { ~T } -11(44.20 \pm 5.55 \%) \), \(4 \mathrm { ~T } -18 (25.26 \pm 5.76 \%) \), \(4 \mathrm { ~T } -19 \quad(24.17 \pm 7.01 \%) \), \(5 \mathrm { ~T } -13 \quad(37.94 \pm 9.16 \%) \), \( 5 \mathrm { ~T } -14(61.25 \pm 2.16 \%) \), \(8 \mathrm { ~T } -2(67.03 \pm 5.90 \%) \), \(9 \mathrm { ~T } -2(31.99 \pm 10.26 \%) \)로 총 \(8 \)개의 소분획물이 AGI activity를 가지는 것으로 나타났다(Fig. \(2 \)). 상기 소분획의 활성물질을 조사하기 위해 LC-MS 분석을 수행하였다.</p>	[ "CP \\( 1 \\) \\( 250 \\mathrm { mg } \\)을 Sepbox chromatography를 이용하여 \\(20 \\)시간 이내에 \\(288 \\)개의 소분획으로 분리하였는데 1-3개의 화합물을 포함한 소분획으로 분리할 수 있었다. 이후 각 소분획물의 \\( \\alpha \\)-glucosidase inhibitory activity를 측정을 위해 농축하고 DMSO에 용해시켰다. AGI 활성 결과 총 8 개의 소분획물이 AGI activity를 가지는 것으로 나타났고, 상기 소분획의 활성물질을 조사하기 위해 LC-MS 분석을 수행하였다." ]
55e-0c9-4ed49a10-4c5a-4728-9465-791a07dc7c89_00	생명LA	자동화 HPLC/SPE/HPLC 시스템(Sepbox system) 을 활용한 고추 잎(leaf of Capsicum annuum L .) 추출물 분리 및 \( \alpha \)-glucosidase 억제활성 물질 탐색	<p>Inhibition rate \( ( \%) = \left [1- \left ( \mathrm { Abs } _ {\mathrm { sample } } - \mathrm { Abs } _ {\text { reference } } \right ) / \mathrm { Abs } _ {\text { control } } \right ] \times 100 \),<ul> <li>\( \mathrm { Abs } _ {\text { sample } } \) : Absorbance of the sample</li> <li>\( \mathrm { Abs } _ {\text { blank } } \) : Absorbance of the sample reference</li> <li>\( \mathrm { Abs } _ {\text { control: } } \) : Absorbance of the control</li></ul></p> <h2>산가수분해</h2> <p>본 연구에서 수행된 가수분해는 CP \( 1 \) \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } ( \mathrm { MeOH } ) \) : water: \( \mathrm { MeOH } : 3 \mathrm { M } \quad \mathrm { HCl } =2 \mathrm { ~mL } : 3 \mathrm { ~mL } : 5 \mathrm { ~mL } : 0 \mathrm { ~mL } \) (control) \( 2 \mathrm { ~mL } : 2.7 \mathrm { ~mL } : 5 \mathrm { ~mL } : 0.3 \mathrm { ~mL } \) (Final \( \mathrm { HCl } \) conc. \( 0.1 \mathrm { M } \) ) \( / 2 \mathrm { ~mL } : 1.5 \mathrm { ~mL } : 5 \mathrm { ~mL } : 1.5 \mathrm { ~mL } \) (Final \( \mathrm { HCl } \) conc. \( 0.5 \mathrm { M } ) / 2 \mathrm { ~mL } : 0 \mathrm { ~mL } : 5 \mathrm { ~mL } : 3 \mathrm { ~mL } \) (Final \( \mathrm { HCl } \) conc. \( 1 \mathrm { M } ) \)로 각각 혼합 후, \( 60 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \(1 \), \(3 \)시간 동안 반응시켰다. 이후, 반응액은 \( 1 \mathrm { M } \mathrm { NaOH } \)로 중화하고 부탄올 분획 후 농축하여 시료화하였다.</p>	[ "본 연구에서 수행된 가수분해는 CP는 일정한 비율로 용액을 각각 혼합한 후, \\( 60 { } ^ {\\circ } \\mathrm { C } \\) 에서 \\(1 \\), \\(3 \\)시간 동안 반응시킨 이후, 반응액은 \\( 1 \\mathrm { M } \\mathrm { NaOH } \\)로 중화하고 부탄올 분획 후 농축하여 시료화하였다." ]
55e-0c9-4448f258-2abe-4db1-b58a-0fbc7b114d97_00	생명LA	고함량 사포나린 함유 보리 어린 순 재배를 위한 식물공장내 인공광 조건 및 사포나린 추출 분석법 최적화	<h2>광 주기에 따른 Saponarin 함량 및 생육량 분석</h2> <p>발아된 보리에 광 온도 \( 6500 \mathrm { ~K } \) 의 LED 를 \( 250 \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \) 과 \( 500 \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } \mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \) 의 광량으로 24시간 1일을 기준으로 광 조사 시간을 \( 8 \mathrm { ~h } \mathrm { day } ^ { -1 } \) 또는 \( 16 \mathrm { ~h } \mathrm { day } ^ { -1 } \) 처리하며 초엽의 길이가 평균 \( 15 \mathrm { ~cm } \) 일 때 수확하여 saponarin 함량 및 200 엽기준 건조 중량을 분석하였다. 그 결과, \( 250 \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \) 과 \( 500 \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \)의 광량으로 \( 8 \mathrm { ~h } \mathrm { day } ^ { -1 } \) 조건으로 광 처리하여 재배한 보리 어린 순의 saponarin 함량이 \( 16 \mathrm { ~h } \mathrm { day } ^ { -1 } \) 조건으로 광 처리하여 재배한 보리 어린 순에 비해 최대 \( 70 \% \) 증가하였고, 보리 어린 순의 건조 중량은 약 \( 7 \% \) 증가하였다(Table \(6 \)). 조사 광량을 500 \( \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } { } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \) 로 증가시킨 경우 saponarin 함량 및 보리 어린순의 건조 중량이 크게 줄어들었으며, 이는 광 스트레스에 의 해 발생한 생리장애로 판단된다. Kozai 등에 의하면 일반작 어린 순의 적절한 생육 관리를 위한 광 조성은 \( 8 \mathrm { ~h } \mathrm { day } { } ^ { -1 } \) 의 광 주기로 \( 500 \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } { } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \) 이하의 광량이 요구되었다.</p>	[ "본 논문에서는 발아된 보리를 이용하여 saponarin 함량 및 200 엽기준 건조 중량을 분석한 결과 광 조성은 \\( 8 \\mathrm { ~h } \\mathrm { day } { } ^ { -1 } \\) 의 광 주기로 \\( 500 \\mu \\mathrm { mol } \\mathrm { m } { } ^ { -2 } \\mathrm { ~s } ^ { -1 } \\) 이하의 광량이 요구된다는 사실을 확인하였다." ]
55e-0c9-4448f258-2abe-4db1-b58a-0fbc7b114d97_01	생명LA	고함량 사포나린 함유 보리 어린 순 재배를 위한 식물공장내 인공광 조건 및 사포나린 추출 분석법 최적화	<h2>광량에 따른 Saponarin 함량 및 생육량 분석</h2> <p>보리 어린 순 재배의 최적 광량 구간을 확인하고자 발아된 보리에 \( 8 \mathrm { ~h } \mathrm { day } ^ { -1 } \) 광 주기로 광온도 \( 6500 \mathrm { ~K } \) 의 LED 광을 \( 70-370 \) \( \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } \mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \) 범위에서 약 \( 50 \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } \mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \) 간격으로 광량을 달리 조절하여 보리 어린 순을 재배한 후 saponarin 함량 및 건조중량을 확인하였다. 그 결과, \( 220-320 \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } \mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \) 의 광 조사 조건에서 saponarin 함량과 건조 중량이 가장 우수함을 확인하였다. 특히, \( 120 \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \) 이하의 광량에서는 보리 어린순의 생육이 느려 건조 수확량이 유의적으로 감소함을 확인하였고, \( 170 \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \) 이상의 광량을 처리했을 때 보리 어린순의 생육이 양호한 것을 확인하였다 (p \(<0.05) \). \(370 \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \)이상의 광량을 처리했을 때는 saponarin 함량 및 건조 중량이 감소하는 경향으로 확인되었다(Fig. \(3 \)). 따라서, 인공광에 의해 보리 어린 순 재배 시 \( 220-270 \mu \mathrm { mol } \mathrm { m } { } ^ { -2 } \mathrm { ~s } ^ { -1 } \) 광량을 조사하는 것이 최적의 생육량을 확보하면서 saponarin 함량을 증진시키는 최적의 광 조건임을 확인 할 수 있었다.</p>	[ "본 논문은 보리 어린순 재배의 최적 광량 구간을 확인하고자 광량을 달리하며 보리 어린순을 재배하고 saponarin 함량 및 건조중량을 확인했다. 그 결과 최적의 생육량 확보 및 saponarin 함량 증진이 가능한 최적의 광 조건을 도출했다." ]
55e-0c9-00670156-acc9-4adb-8f9e-3027306c02b0_01	생명LA	LC-MS/MS를 이용한 생약 백출 및 우슬 중 Metalaxyl 잔류분석법 개발	<p>ME \( ( \%) = \left ( \frac {\text { Slope of matrix-matched calibration } } {\text { Slope of solvent calibration } } \right ) \times 100 \)</p> <h2>분석정량한계 및 회수율 확인</h2> <p>Metalaxyl 분석을 위한 각각 전처리법을 확립한 후 기기정량한계, 시료채취량, 시험용액 부피, 희석배수 및 농축배수를 고려하여 분석정량한계(Method limit of quantitation, MLOQ)를 산출하였다. 또한, metalaxyl 잔류분석의 정확성과 정밀성을 확인하기 위해 회수율 실험을 수행하였다. 처리수준은 MLOQ 및 MLOQ의 \( 10 \)배가 되도록 metalaxyl 표준용액을 백출, 우슬 \( 5 \mathrm { ~g } \)에 처리하였다. 시료 \( 5 \mathrm { ~g } \) 에 물 \( 10 \mathrm { ~mL } \) 를 첨가하여 \( 10 \)분간 습윤화 후 acetonitrile \( 20 \mathrm { ~mL } \) 을 첨가하였다. 그리고 \( 1,300 \mathrm { rpm } \) 으로 \( 3 \)분간 진탕 후 \( 4 \mathrm { ~g } \mathrm { MgSO } _ { 4 } \) , \( 1 \mathrm { ~g } \mathrm { NaCl } \) 을 첨가하여 \( 1 \)분간 추가 진탕하였다. 그 후 원심분리기를 이용하여 \( 4,000 \mathrm { rpm } \) 에서 \( 5 \)분간 원심분리하였고, 상등액 \( 5 \mathrm { ~mL } \) 를 분취하여 acetone/ \( n \)-hexane \( (50/ 50, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) \( 5 \mathrm { ~mL } \) 로 활성화 시킨 \( \mathrm { SPE } - \mathrm { NH } _ { 2 } \) cartridge에 첨가하였다. 그 후 acetone / \( n \)-hexane \( (50 / 50, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) \( 5 \mathrm { ~mL } \) 로 용출 후 질소 건고 후 acetonitrile \( 5 \mathrm { ~mL } \) 에 녹여서 \( 800 \mu \mathrm { L } \) 를 취해 acetonitrile \( 200 \mu \mathrm { L } \) 와 혼합하여 시험용액으로 하였다.</p>	[ "Metalaxyl 분석을 위한 각각 전처리법을 확립한 후 기기정량한계, 시료채취량, 시험용액 부피, 희석배수 및 농축배수를 고려하여 분석정량한계(Method limit of quantitation, MLOQ)를 산출하였다. metalaxyl 잔류분석의 정확성과 정밀성을 확인하기 위해 회수율 실험을 수행하였다." ]
55e-0c9-00670156-acc9-4adb-8f9e-3027306c02b0_00	생명LA	LC-MS/MS를 이용한 생약 백출 및 우슬 중 Metalaxyl 잔류분석법 개발	<h2>HPLC-MS/MS 분석법 검증</h2> <p>Metalaxyl의 matrix-matched 표준용액 \( 0.001-0.05 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 를 HPLC-MS/MS 에 \( 2 \mu \mathrm { L } \) 씩 주입하여 chromatogram상의 \( \mathrm { s } / \mathrm { n } \) ratio가 \( 3 \) 이상인 농도를 기기검출한계(ILOD), \( 10 \)이상인 농도를 기기정량한계(ILOQ)로 설정하였다. 재현성을 확인하기 위해서 metalaxyl의 matrix-matched 표준용액 \( 0.001 \mathrm { mg } / \mathrm { L } \) 를 반복으로 \( 7 \)번 분석하였다. \( 0.001-0.05 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도를 분석 후 검량선을 작성하고 직선성을 확인하였다.</p> <h2>정제 조건 검토</h2> <p>\( 5 \)가지의 d-SPE와 \( \mathrm { SPE } \) - \( \mathrm { NH } _ { 2 } \) cartridge를 각각 검토하였다. 먼저 \( 5 \)가지 각각의 d-SPE에 metalaxyl 표준용액 \( 0.1 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 를 \( 1 \mathrm { ~mL } \) 첨가하여 검토하였다. 정제시약으로 흡착제 PSA, C \( 18 \), GCB, Z-Sep이 들어가 있는 다양한 종류 및 조성에 따른 정제효율을 검토하였고 d-SPE tube 구분은 Table \( 1 \)과 같다. 다음으로 SPE- \( \mathrm { NH } _ { 2 } \) cartridge 검토는 acetone/n-hexane의 혼합조성을 이용하여 metalaxyl의 용출 정도를 확인하였다. Acetone/ \( n \)-hexane \(( 5/95, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) \( 5 \mathrm { ~mL } \) 로 활성화한 후, metalaxyl 표준용액 \( 10 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 를 \( 1 \) \( \mathrm { mL } \) 질소농축 후 acetone/ \( n \)-hexane \( (5 / 95, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) \( 5 \mathrm { ~mL } \) 로 재용해 된 용액을 카트리지에 첨가한 후 acetone/ \( n \)-hexane \( (5 / 95, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 두 분획, acetone/ \( n \)-hexane \( (10 / 90, \mathrm { v } / \mathrm { v } ) \) 두 분획을 각각 \( 5 \mathrm { ~mL } \)씩 용출시켜 검토 확인하였다. 또한, 보다 최적화된 분석법 확립을 위하여 회수율을 확보한 d-SPE와 \( \mathrm { SPE } - \mathrm { NH } _ { 2 } \) cartridge를 이용하여 백출, 우슬 각각의 matrix effect를 검토하였다. Matrix effect는 다음과 같이 산출하였다.</p>	[ "Metalaxyl의 matrix-matched 표준용액과 chromatogram상의 \\( \\mathrm { s } / \\mathrm { n } \\) ratio가 3이상인 농도를 기기검출한계, 10이상인 농도를 기기정량한계로 설정하여, 농도를 분석 후 검량선을 작성하고 직선성을 확인하였고, 5가지의 d-SPE와 SPE- \\( \\mathrm { NH } _ { 2 } \\) cartridge를 이용하여 백출, 우슬 각각의 matrix effect를 검토하였다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-467b-42da-b565-de0d940c3090_01	생명LA	제주 동백나무 겨우살이를 첨가한 막걸리의 항산화 및 항비만 활성	<h2>재료 및 방법</h2> <h3>실험재료 및 기기</h3> <p>세포 독성 실혐 및 배양을 위한 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 는 Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) 의 제품을 사용하였으며 Dulbeco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 Antibiotic-Antimyotic (100X)는 Gibco (Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였다. 유효성 평가를 위한 Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), Pro-COL1 \( 11, \beta \)-actin 항체는 undefined 하여 사용하였으며, MMP-1, Pro-collagen kit는 각각 \( \Lambda \) bcam (Cambridge, MA, USA), TaKaRa (Shiga, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 microplate reader 장비는 Spectrostar Nano (BGM LabTech, Ortenberg, Germany)를 사 용하였으며, Chemi-Doc은 LAS4000 (Fuji Film, Tokyo, Japan) 제품을 사용하었다.</p> <h3>세포배양</h3> <p>American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA) 에서 구매한 CCD-986sk (Human fibroblast) 세포를 \( 10 \% \) FBS, \( 5 \% \) antibiotic-antimyotic을 첨가한 DMEM으로 배양기에 서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \) 조건으로 배양하였다.</p> <h3>세포독성축정</h3> <p>본 실혐에서 CCD-986sk 세포에 대한 시료의 유효농도를 결정 하기 위해 세포독성측정(MTT assay)을 진행하였다. 배양된 CCD-986sk 세포를 48 well plate에 각각 \( 5 \times 10 ^ { 4 } \mathrm { cell } / \mathrm { wells } \) 로 접종하고 24 시간 배양하였다. 둥일 배지로 교체한 후 casuarictin 을 농도별 \( (5,10,25,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \) 로 희석하여 처리한 후 48시간 CO2 incubator에서 배양하였다. 5 mg/mL MTT 용액과 \( 10 \% \) FBS, \( 5 \% \) antibiotic-antimyotic을 첨가한 DMEM을 혼합 하여 세포에 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 씩 처리한 후 3 시간 배양하였다. Demethyl sulfoxide \( 100 \mu \mathrm { L } \) 넣은 후, 10 분간 교반 한 후 microplate reader 로 \( 540 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h3>ROS (Reactive Oxygen Species) 생성량 측정</h3> <p>CCD-986sk 세포를 배양한 후 96 well white plate에 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cell/wellse로 접종하고 24 시간 배양하였다. 동일 배지로 교체한 후 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \) 을 조사 한 뒤, casuarictin을 \( 5,10,25 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도로 희석하여 처리한 후 48 시간 배양하였다. 그 후 제조사의 매뉴얼에 따라 ROS Clo \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) assay를 수행하였다.</p>	[ "3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]- 2,5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), Dulbeco's modified Eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS) 및 Antibiotic-Antimyotic (100X)를 사용하여 CCD-986sk (Human fibroblast) 세포를 \\( 10 \\% \\) FBS, \\( 5 \\% \\) antibiotic-antimyotic을 첨가한 DMEM으로 \\( 37 ^ {\\circ } \\mathrm { C } , 5 \\% \\mathrm { CO } _ { 2 } \\) 조건으로 배양하였다. Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1), Pro-COL1 \\( 11, \\beta \\)-actin 항체는 undefined 하여 사용하고 MMP-1, Pro-collagen kit는 각각 \\( \\Lambda \\) bcam, TaKaRa에서 구입하여 사용하였다. Spectrostar Nano, Chemi-Doc LAS4000 장비를 사용하여 American Type Culture Collection (ATCC)에서 구매한 CCD-986sk 세포 독성 실험 및 배양을 수행하였다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-467b-42da-b565-de0d940c3090_00	생명LA	제주 동백나무 겨우살이를 첨가한 막걸리의 항산화 및 항비만 활성	<h1>UVB유도성 CCD-986sk cell에서의 Casuarictin의 항노화 효과</h1> <h2>서 론</h2> <p>피부노화는 잔주름, 피부건조증, 타력감소 등의 경미한 임상 특징을 나타내는 내인성 노화와 굵고 깊은 주름이 발생하며 잔주 름도 많이 발생하는 광노화로 나눌 수 있다(Jean 1995; Laure 와 Fisher 2002).</p> <p>세포외기질(cxtracellular martix)의 주요. 구성성분인 collagen 은 섬유아세포에 의해 합성되며, 피부의 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착, 세포 분할과 분화유도 등의역할을 한다(Jeroma 등, 1998). 피부에 높은 농도로 존재하는collagen은 트립신과 같은 단백질 분해효소의 작용은 받지 않으나 collagenasc에 의해 분해된다(Girant와 Alburn 1959; Demina 와 Lysenko 1996). 광노화로 인한 피부 주름은 진피의 collagen을 포함한 결합 조직 성분을 분해하는 matrix mctalloprotcinases (MMPs)의 활성이 증가하여 피부 조직 내의 collagen 함량이 저하되기 때문이며,, 자외선 조사량이 증가할수록 MMPs의 활성이증가하는 것으로 보고되어 있다(Park 등, 2008; So 등, 2008). Ultraviolet B (UVB)는 피부 세포내 활성 산소를 생성하여직접 DNA의 손상을 일으켜 항산화 방어체계의 불균형에 의한산화적 스트레스를 유발시킨다. 또한, 활성산소종은 MMPs의 활성을 증가시켜 결합조직성분의 분해, 절단 및 비정상적인 교차결합에 의하여 주름을 생성시킨다(Afaq 등, 2007; Park과 Lee 2008). 즉 자외선에 의한 활성산소종은 피부 세포 내 여러 가지 신호 전달체계를 활성화시킴으로서 MMPs의 증가를 가져오며 이는 collagen의 생성과 탄력섬유의 합성을 감소시켜 주름을생성하게 되는 피부노화의 주된 원인임을 알 수 있다(Berncburg 등 2000).</p> <p>Casuarictin은 가수분해성 tannin의 한 종류인 ellagitannin monomer로 Casuarina과 Stachyurus 총 식물에 존재한다고 알려 저 있다(Okuda 등, 1983). 구조적으로 2개의 hexahydroxydiphicnic acid와 1개의 gallic acid unit이 glucose moleculc에 연결되어 있는 형태로 \( \mathrm { pH } 8 \) 의 buffer 하에서 가수분해되어 많은 양의 cllagic acid를 생성한다고 보고되었다(Danicl 등, 1991). 현재까 지 알려진 Casuarictin의 효능은 항암(Miyamoto 등, 1993), 항염(Ishii 등, 1999), 항산화(Kahkonen 등, 2012) 등이 있다. Casuarictin을 포함하는 ellagitannins은 1,2,3,4,6-pentagalloyl glucose의 galloyl groups의 산화에 의해 주로 생성되는 polyphenol의 부류를 말한다. 이는 일부 과일류와 pomegranates, black raspberries, raspberries, strawberries, walnuts 및 almonds 와 같은 nuts와 seeds에 주로 존재하며(Amakura 등, 2000), 항 암, 항염, 항산화 효과를 가지는 것으로 보고 되어있다(Lipiñska 등, 2014). 관절염유도동물 모델에서 ellagitannin이 풍부한 red raspberries 추출물이 우수한 항염증효과를 가지는 것으로 보고 되었으며(Jean-Gilles 등, 2012), 용안씨 추출물(longan seed extacts)의 ellagitannins 계열 물질은 미백효과가 있는 것이 알려 져 있다(Rangkadiloka 등, 2007). 지금까지 ellagitannin계 물질 에 대한 다양한 효능에 대해 연구가 진행되었으나 casuarictin에 대한 개별연구는 부족한 실정이며 특히 항암, 항염, 항산화 이 외의 효능에 대한 연구는 거의 이루어지지 않고 있는 실정이 다. 따라서, 본 실혐에서는 복분자 씨앗 추출물로부터 분리된 casuarictin을 이용하여 기존에 밝혀지지 않은 섬유아세포내에서 의 항노화 효과를 확인하여 기능성 화장품 소재로의 이용 가능 성을 확인하고자 하였다.</p>	[ "collagen은 피부의 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착, 세포 분할과 분화유도 등의 역할을 하는데, 자외선에 의한 활성산소종은 피부 세포 내 여러 가지 신호 전달체계를 활성화시켜 collagen의 생성과 탄력섬유의 합성을 감소시켜 주름을생성하게 되는 피부노화의 주된 원인이다. ellagitannin monomer로 Casuarina과 Stachyurus 총 식물에 존재한다고 알려져 있는 Casuarictin은 UVB유도성 CCD-986sk cell에서 항노화하는 효과가 있어, 본 실험에서는 복분자 씨앗 추출물로부터 분리된 casuarictin을 이용해 섬유아세포내에서 의 항노화 효과를 확인하여 기능성 화장품 소재로 이용할 수 있는지 확인하고자 한다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-467b-42da-b565-de0d940c3090_03	생명LA	제주 동백나무 겨우살이를 첨가한 막걸리의 항산화 및 항비만 활성	<h2>결과 및 고찰</h2> <h3>세포독성 평가</h3> <p>Casuarictin의 세포 독성측정과 실험에 사용될 농도 범위 결정 을 위해 MTT assay를 수행하였다. CCD-986sk 세포에 casuarictin을 \( 5,10,25,50,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 농도로 처리한 결과, \( 25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 이하의 농도에서 세포생존율이 \( 90 \% \) 이상으로 나타 내어 CCD-986sk 세포의 생존율에 큰 영향을 나타내지 않음을 확인 할 수 있었다(Fig. 1)</p> <h3>\( \operatorname { ROS } \) 생성 억제 효과</h3> <p>피부에 UVB의 노출은 활성산소종 생성을 야기시키며(Fisher 등, 1997; Yoon 등, 2003; Han 등, 2013), 이때 생성되는 ROS는 피부세포 내에서의 신호전달 과정화에 영향을 미쳐 피부 주름 과 관련된 전사인자들을 활성화 시킨다(Pentland 등, 1995; Park 등, 2010). CCD-986sk 세포에서의 UVB 조사에 따른 ROS 생 성을 측정한 결과, UVB로 유도된 그룹에서는 정상군에 비해 2 배 가까이 ROS 생성률이 증가하였으며, casuarictin을 농도별로 처리한 결과 농도 의존적으로 ROS 생성을 감소시키는 것을 확 인하였다(Fig. 2).</p> <h3>Pro-collagen 합성 및 MMP-1 발현 추정 결과</h3> <p>피부 세포의 주름과 관련된 collagens은 pro-collagen이라는 전 구물질의 형태로 합성된다. 따라서 pro-peptide의 양을 측정함으 로써 세포내에서의 collagen의 합성 정도를 파악할 수 있다 (Parfitt 등, 1987). Pro-collagen의 합성을 촉진 시킬 수 있는 소재는 탄력 있는 피부를 만들어 주는 화장품 원료로서 사용 가능성이 높다고 생각되며 이에 casuarictin을 이용하여 pro-collagen 합성 실험을 수행하였다. 그 결과, casuarictin은 농도의존적으로 pro-collagen 생성을 증가 시켰으며, 특히 최고 농도 인 \( 25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도에서는 대조군에 비해 \( 20 \% \) 이상의 높은 생성률을 나타내었다. 또한 MMP-1은 type collagen을 분해하는 인자로 알려저 있으므로(Talwar 등, 1995; Nagase와 Woessner 1999) 이 인자의 발현을 지해하는 것이 피부의 탄력유지에 효 과를 줄 수 있을 것으로 예측되는바 casuarictin의 MMP-1의 발 현 지해율 측정 실혐을 수행하였 다. 그 결과, UVB로 발현된 MMP-1을 control과 비교하였을 때 casuarictin이 \( 5,10,25 \) \( \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 의 농도에서 각각 \( 14,15,22 \% \) 의 발현을 저해하는 것을 확인하였다(Fig. 3).</p>	[ "MTT assay 수행을 통해 실험에 사용될 농도범위를 결정하고 Casuarictin의 세포 독성을 측정하였다. CCD-986sk 세포를 결정된 범위의 농도별 Casuarictin으로 처리해본 결과 \\( 25 \\mu \\mathrm { g } / \\mathrm { mL } \\)이하의 농도에서는 세포의 생존율에 미미한 영향을 미친다는 것을 확인하였다.UVB의 노출시 피부에 생성되는 ROS는 피부주름 관련 전사인자들을 활성화 시킨다.UVB 는 ROS 생성률를 2배 가까이 증가시켰으며,casuarictin 농도별 처리결과 ROS생성률이 농도에 의존적으로 감소되었다." ]
55e-0c9-merge_la_28a7cd33-467b-42da-b565-de0d940c3090_02	생명LA	제주 동백나무 겨우살이를 첨가한 막걸리의 항산화 및 항비만 활성	<h3>Pro-collagen 합성 및 MMP-1 발현 측정</h3> <p>CCD-986sk 세포를 배양한 후 6 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cell/wells 로 접종하고 24시간 배양하였다. 동일 배지로 교체한 후 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \) 을 조사 한 뒤, casuarictin을 \( 5,10,25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 희 석하여 처리한 후 48 시간 배양하였다. Blank와 control group은 sample의 처리없이 배양하였으며 그 후 각 well의 상등액을 이 용하여 procollagen type C-peptide assay kit와 MMP-1 hunam ELISA kit을 사용하여 실혐을 진행한 뒤, microplate reader로 \( 450 \mathrm { ~nm } \) 에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h3>Western Blot을 이용한 단백질의 발현 측정</h3> <p>CCD-986sk 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cell } / \) wells로 6 well plate에 분주하 여 24시간 배양한 후에 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \) 를 조사한 뒤 casuarictin을 처리하여 48시간 배양하였다. 세포를 RIPA buffer (Pierce, Rockford, IL, USA)로 용해하고 원심분리한 후 얻은 상층액을 \( 10 \% \) SDS-PAGE를 이용해 전기영동하고 PVDF membrane으로 이전시켰다. \( 5 \% \) skim milk가 함유된 tris 완충 용엑으로 1시간 blocking 한 후, Pro-collagen, MMP-1, \( \beta \)-actin 각각의 1 차 및 2 차 항체와 반응시켰다. 반응 후 Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate (Millipore, Billerica, \( \mathrm { M } \Lambda, \mathrm { US } \Lambda \) )를 이용하여 60 분간 반응시킨 후 Chemi-Doc을 이용 하여 현상하였다.</p> <h3>통계처리</h3> <p>본 실험의 통계처리는 SPSS \( 12.0 \) 을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 각 실험군의 간의 결과는 2 -표본 \( \mathrm { t } \) 검정을 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있 는 항목에 대해서만 검정하였다. 실혐군 간의 차이는 \( 95 \% \) 수 준 \( \left ( { } ^ { * } p<0.05, { } ^ { * * } p<0.01 \right ) \) 에서 유의성 있는 것으로 하였다.</p>	[ "Blank와 control group은 sample의 처리없이 배양하였으며 그 후 각 well의 상등액을 이용하여 procollagen type C-peptide assay kit와 MMP-1 hunam ELISA kit을 사용하여 실혐을 진행하였고, Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate를 이용하여 60 분간 반응시킨 후 Chemi-Doc을 이용 하여 현상하였다. 실혐군 간의 차이는 \\( 95 \\% \\) 수준에서 유의성 있는 것으로 하였다." ]
55e-0c9-a04d629f-4180-4d3f-9c3a-adbfa58eb731	생명LA	국화 ‘백마’(Chrysanthemum morifolium ) 줄기로부터 glycosyl glyceride 의 분리 및 동정	<h1>서 론</h1><p>국화는 국화과(Asteraceae)에 속하는 여러해살이풀로 주로 아시아 등지에서 서식한다. 국화는 약 \( 1 \mathrm{~m} \) 크기로 자라며, 품종에 따라 여름부터 늦가을까지 개화한다. 국화는 관상용으로 가장 많이 쓰이며, 방향제나 차, 한약재등으로 사용된다. 국내 관상화훼농업에서 국화의 시장가치는 두번째로 높은 수준을 차지하며, 다양한 품종이 육종 개발되고있다. 현재 국화는 700 종 이상의 품종이 개량되었고, 크게 대국인 스탠다드형과 소국인 스프레이형으로 나뉜다. 이중 국내 생산비는 스탠다드형이 80% 이상으로 압도적인 점유율을 갖는다. 이에 힘입어 2004년 한국 농촌진흥청 원예연구소에서는 국내 최초로 ‘백마(白馬)'라는 스탠다드형 국화를 육종하였다. 백마는 현재 국내뿐만 아니라 세계 각국으로 수출되고 있으며, 주로 관상용으로 활용된다. 관상용 국화는 주로 절화로 유통되며, 유통 과정 중 다량의 부산물이 발생한다. 부산물 중 가장 높은 비율을 차지하는 부위는 국화의 줄기로 폐기 과정 중 농가에 추가비용을 발생시킨다. 국화 줄기는 항산화, 혈전 생성 억제, 관상동맥의 혈행 개선, 관상동맥성 심질환 치료의 활성을 가지고 있으나 다른 부위에 비해 많은 연구가 이루어져 있지 않다. 따라서 농가의 비용 감소와 소득증대를 위해 부산물에 대한 활용방안이 촉구되며, 부산물의 활용 가능성 평가를 위해 국화 줄기에 대한 연구를 시작하였다.</p><h1>재료 및 방법</h1><h2>실험재료</h2><p>본 실험에서 사용한 국화 '백마'(C. morifolium) 의 줄기는 스탠다드형 국화의 줄기로 2017년 4월에 양재꽃시장(서울, 대한민국)에서 구입하였으며, 충청남도 농업기술원 화훼연구소(충청남도 예산군 오가면 역탑리) 박하승 박사가 동정하였다. 백마는 국내에서 최초로 육종한 흰색의 볼륨감 있는 스탠다드형 절화용 하추국으로 꽃의 중심부가 노란 빛을 띄는 다른 국화 품종과는 달리 중심부가 녹색을 띄고있어 동정이 가능하다. 표본시료(KHU-NPCL-20170430)는 경희대학교 천연물화학실 (용인, 경기도)에 보관되어 있다.</p><h2>시약 및 기기</h2><p>시약 및 기기는 이전 실험과 동일하게 사용하였다</p><h2>추출 및 분리</h2><p>국화 '백마'의 건조한 줄기 \( 3.3 \mathrm{~kg} \) 을 \( 80 \% \mathrm{MeOH} \) 수용액(\(30\) L) 으로 실온에서 \(24\) 시간씩 \(3\)회 반복 추출하였다. 얻어진 여액을 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 감압농축하여 \( \mathrm{MeOH} \) 추출물(\(177\) g)을 얻었다. 얻어진 \( \mathrm{MeOH} \) 추출물은 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) (\(3.0\) L)와 ethyl acetate \((\mathrm{EtOAc}\), \( 3.0 L \times 3 \) )로 분배추출하였고, 다시 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 층을 \( n \)-butyl alcohol (n-\( \mathrm{BuOH}, 2.4 \mathrm{~L} \times 3) \) 로 분배추출하였다. 각층을 \( 40^{\circ} \mathrm{C} \) 에서 감압농축 하여 \( \mathrm{EtOAc} \) 분획(CBAE, \( 19.3 \mathrm{~g}), n \)-BuOH 분획(CBAB, \( 18.9 \mathrm{~g}) \) 및 \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O} \) 분획(CBAW, \( \left.138.8 \mathrm{~g}\right) \) 을 얻었다. \( \mathrm{EtOAc} \) 분획(CBAE, \( 19.3 \mathrm{~g}) \) 에 대하여 silica gel \( \left(\mathrm{SiO}_{2}\right) \) column chromatography (c.c.) \( \left(\phi 10.0 \times 15.0 \mathrm{~cm}, \quad \mathrm{CHCl}_{3}-\mathrm{EtOH}=10: 1 \rightarrow \mathrm{CHCl}_{3}-\mathrm{MeOH}=10: 1 \rightarrow \mathrm{CHCl}_{3}-\right. \) \( \mathrm{MeOH}=5: 1 \), 각 \( 3.0 \mathrm{~L}) \) 를 실시하여, 총 \(13\) 개의 분획 \( (\mathrm{CBAE}- \) 1 CBAE-13)을 얻었다. 그 중에서 CBAE-10 분획[\(490.9 mg\), elution volume/total volume (Ve/ \( \mathrm{Vt}) \quad 0.098-0.119] \) 에 대하여 octadecyl silica gel (ODS) c.c. \( (\phi 3.5 \times 6 \mathrm{~cm} \), acetone-MeOH-\( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}=3: 1: 1 \), 각 \( 2.5 \mathrm{~L} \) )를 실시하여 화합물 \( 1 \) (CBAE-10-16, \( 64.5 \mathrm{mg} \), \( \mathrm{Ve} / \mathrm{Vt}=0.355-0.419 \), ODS TLC \( \mathrm{R}_{\mathrm{f}} 0.17 \) acetone-MeOH- \( \mathrm{H}_{2} \mathrm{O}= 5:1:1\))과 화합물 \(2\) (CBAE-10-21, \( 17.4 \mathrm{mg}, \mathrm{Ve} / \mathrm{Vt}=0.548-0.608 \), ODS TLC \( \mathrm{R}_{\mathrm{f}} 0.31 \) acetone-MeOH- \( \left.\mathrm{H}_{2} \mathrm{O}=5: 1: 1\right) \) 을 분리하였다.</p>	[ "국화는 관상용이나 방항제, 한약재로 쓰이는데, 이러한 국화의 유통에는 다량의 부산물이 발생한다. 이중 많은 비율을 차지하는 것이 줄기인데, 이러한 줄기는 항산화, 혈전 생성 억제, 관상동맥의 혈행 개선, 관상동맥성 심질환 치료의 활성을 가지나 관련 연구는 미흡한 실정이다. 따라서 본 연구는 국화의 한 품종인 백마의 특징인 중심부가 녹색인 점을 이용해 동정을 실시하였다." ]
55e-0c9-1ed4d63c-4de2-4e1a-a650-d0f2c19a533d	생명LA	국화 ‘백마’(Chrysanthemum morifolium ) 줄기로부터 glycosyl glyceride 의 분리 및 동정	<h1>결과 및 고찰</h1><p>화합물 1은 negative FAB-MS 에서 \( m / z \ 777 [\mathrm{M}-\mathrm{H}]^{-} \)의 분자이온 peak가 관측되어 분자량을 778로 결정하였다. \( \mathrm{IR} \) 스펙트럼으로부터 수산기 \( \left(3383 \mathrm{~cm}^{-1}\right) \), 카보닐기 \( \left(1723 \mathrm{~cm}^{-1}\right) \), 이중결합 \( \left(1612 \mathrm{~cm}^{-1}\right) \) 이 있는 것으로 확인되었다. \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR}(400 \mathrm{MHz} \),\( \mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD}, \delta_{\mathrm{H}} \) ) 스펙트럼에서 \( \delta_{\mathrm{H}} \) 5.40-5.30 부근에서 여덟 개의 olefin methine proton 이 발견되었고, \( \delta_{\mathrm{H}} 5.30 \) 에서 oxygenated methine proton, \( \delta_{\mathrm{H}} 4.46 / 4.18,3.86 / 3.64 \) 에서 oxygenated methylene proton 두 개가 발견되었다. 두 개의 말단 methyl proton signal이 \( \delta_{\mathrm{H}} 0.97(6 \mathrm{H}) \) 에서, 여섯 개의 allyl methylene proton signal이 \( \delta_{\mathrm{H}} 2.80(4 \mathrm{H}), \delta_{\mathrm{H}} 2.06(8 \mathrm{H}) \) 에서, 14개의 methylene proton signal 이 \( \delta_{\mathrm{H}} 1.32-1.26(28 \mathrm{H}) \) 에서 관측되어 두 개의 \( n- \) aliphatic 지방산이 있음을 예상하였다. 하나의 oxygenated methine 이 \( \delta_{\mathrm{H}} 5.30(\mathrm{H}-2) \) 에서 관측되고, 두 개의 oxygenated methylene 이 각각 \( \delta_{\mathrm{H}} 3.86(\mathrm{H}-1 \mathrm{a}), \delta_{\mathrm{H}} 3.64(\mathrm{H}-1 \mathrm{~b}), \delta_{\mathrm{H}} 4.46 \)(H-3a), \( \delta_{\mathrm{H}} 4.18 \) (H-3b)에서 관측되어, glycerol이 존재함을 예상하였다. Oxygenated methylene \( \left(\delta_{\mathrm{H}} 4.46, \mathrm{H}-3 \mathrm{a} ; 4.18, \mathrm{H}-3 \mathrm{~b}\right) \)과 oxygenated methine \( \left(\delta_{\mathrm{H}} 5.30, \mathrm{H}-2\right) \) signal을 비교하여 화합물 1 이 두 개의 ester bond를 \( \mathrm{C}-2 \) 와 \( \mathrm{C}-3 \) 에 가진 구조임을 예상하였다. 당에서 유래한 1개의 hemiacetal proton signal \( \left(\delta_{\mathrm{H}}\right. \) \( 4.24,1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=8.0 \mathrm{~Hz}) \), 4개의 oxygenated methine signal \( \left(\delta_{\mathrm{H}} 3.79 ; 3.75 ; 3.49\right), 1 \) 개의 oxygenated methylene signal \( \left(\delta_{\mathrm{H}} 3.71,2 \mathrm{H}\right. \), overlapped, \( \left.\mathrm{H}-6^{\prime}\right) \) 의 chemical shift 및 anomer proton signal의 결합정수 \( (J=8.0 \mathrm{~Hz}) \) 로부터 당의 구조가 \( \beta \) -galactopyranose임을 예상하였다. 이를 통해 이 화합물이 glycosyldiglyceride임을 예상하였다. \( { }^{13} \mathrm{C} N M R\left(100 \mathrm{MHz}, \mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD}, \delta_{\mathrm{C}}\right) \) 스펙트럼에서 탄소수가 45개임을 확인하였으며, 이를 통해 탄소 수 18 개의 지방산 2 분자를 갖는 glycosyl diglyceride 화합물임을 확인하였다. 당의 chemical shift \( \delta_{\mathrm{C}} 105.2\left(\mathrm{C}-1^{\prime}\right), 74.7 \) \( \left(\mathrm{C}-3^{\prime}\right), 74.4\left(\mathrm{C}-5^{\prime}\right), 72.3\left(\mathrm{C}-2^{\prime}\right), 70.2\left(\mathrm{C}-4^{\prime}\right), 62.2\left(\mathrm{C}-6^{\prime}\right) \) 를 통해 이 당이 \( \beta \)-galactopyranose임을 확인하였다. 두 개의 ester\( \left(\delta_{\mathrm{C}} 175.5,175.3\right) \), 여덟 개의 olefin methine \( \left(\delta_{\mathrm{C}} 131.1,131.0\right. \),\( 129.2 \times 4,128.8 \times 2) \), 여섯 개의 allyl methylene \( \left(\delta_{\mathrm{C}}\right. \) 28.1-26.4), 18개의 methylene \( \left(\delta_{\mathrm{C}} 35.1-26.0\right) \), 그리고 두 개의 terminal methyl \( \left(\delta_{\mathrm{C}} 14.7 \times 2\right) \) carbon signal 들을 관측하였고 두 개의 지방산이 있음을 확인하였다. \( { }^{13} \mathrm{C}-\mathrm{NMR} \) 의 chemical shift값을 통해 linoleic acid에 이중결합이 Z형태를 갖는 것을 알 수 있었다. Glycosyl glyceride와 같은 화합물의 경우 \( \mathrm{NMR} \) 의 \( 1 \mathrm{D} \) data에서 glycerol에 결합한 지방산의 이중결합의 개수를 알 수 있고, \( { }^{13} \mathrm{C} \) data의 signal 개수와 chemical shift를 통해 구조를 대략적으로 예상할 수 있으나, 지방산으로부터 유래된 다수의 signal이 겹쳐져 관측되어 정확한 구조동정이 불가능하다. 따라서 \( \mathrm{GC} / \mathrm{MS} \) data를 통해 각 물질에 결합한 지방산을 확실히 동정한 후, glycerol에 결합한 위치를 \( \mathrm{NMR} \) 의 \( 2 \mathrm{D} \) data를 통해 확인하면, glycosyl glyceride의 정확한 구조동정이 가능하다. 알칼리 가수분해와 용매 분획을 통해 얻어진 지방산은 \( \mathrm{GC}-\mathrm{MS} \) 스펙트럼으로부터 \( 12.96 \mathrm{~min} \) 에서 peak를 관측하였고, mass 스펙트럼을 문헌(Wiley 9 Library)과 비교하여 linoleic acid로 동정하였다. 또한 화합물 1 의 광학회전 값 \( \left([\alpha]_{\mathrm{D}}^{25}+26.0^{\circ}, c=0.10, \mathrm{MeOH}\right) \) 이 문헌값과 유사함을 확인하였고, 식물의 glycosylglyceride의 생물발생학적 관점으로 보았을 때, C-2의 절대 배열이 \( S \) 임을 알 수 있다. 위의 data를 문헌값 [6]과 비교하여 화합물 1을 (2S)-1-\( O-\beta \)-D-galactopyranosyl-2,3-dilinoleoylglycerol로 구조동정 하였다.</p><p>화합물 2는 positive FAB-MS 에서 \( m / z \quad 731[\mathrm{M}+\mathrm{H}]^{+} \)의 분자이온 peak가 관측되어 분자량을 730 으로 결정하였다. IR 스펙트럼으로부터 수산기 \( \left(3383 \mathrm{~cm}^{-1}\right) \), 카보닐기 \( \left(1723 \mathrm{~cm}^{-1}\right) \) 가 있는 것으로 확인되었다. \( { }^{1} \mathrm{H} \mathrm{NMR}\left(400 \mathrm{MHz}, \mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD}, \delta_{\mathrm{H}}\right) \) 과 \( { }^{13} \mathrm{C} \) \( \mathrm{NMR}\left(100 \mathrm{MHz}, \mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD}, \delta_{\mathrm{C}}\right) \) 스펙트럼을 통하여 화합물 1 과 같은 구조에 지방산 두 개가 다른 구조임을 확인하였다. 알칼리 가수분해와 용매 분획을 통해 얻어진 지방산은 GC-MS 스펙트럼으로부터 \( 11.06 \) min에서 peak를 관측하였고, mass 스펙트럼을 문헌(Wiley 9 Library)과 비교하여 palmitic acid로 동정하였다. 또한 화합물 2 의 광학회전 값 \( \left([\alpha]_{\mathrm{D}}^{25}+26.4^{\circ}, c=0.10\right. \), \( \mathrm{MeOH}) \) 이 문헌값 [7]과 유사함을 확인하였고, 식물의 glycosyl-glyceride의 생물발생학적 관점으로 보았을 때, \( \mathrm{C}-2 \) 의 절대 배열이 \( S \) 임을 알 수 있다. 위의 data를 문헌값과 비교하여 화합물 2를 (2S)-1-O- \( \beta \)-D-galactopyranosyl-2,3-dipalmitoylglycerol로 구조동정 하였다.</p>	[ "화합물 1은 분자량이 778인 glycosyl diglyceride 화합물이며 화합물 2는 분자량 730이고 화합물 1 과 같은 구조에 지방산 두 개가 다른 구조이다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-4e3f-4b1e-8a92-40da4837be5f_02	생명LA	국화 ‘백마’(Chrysanthemum morifolium ) 줄기로부터 glycosyl glyceride 의 분리 및 동정	<h2>Glycosyl glyceride \(1 \) 과 \(2 \) 의 알칼리 가수분해</h2> <p>각 화합물 \( (1.0 \mathrm { mg } ) \) 을 \( 20 \% \mathrm { KOH } / \mathrm { MeOH } (2 \mathrm { ~mL } ) \) 에 녹여 \( 80 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 의 항온 수조에 60 분 동안 방치하였다. 이를 실온에서 식힌 후, \( \mathrm { TLC } \) 에서 초기 물질의 소멸 양상을 관측하고 \( \left ( \mathrm { CHCl } _ { 3 } - \mathrm { EtOH } \right . \) \( = 7: 1 \) ), 산성 양이온 교환수지(Dowex \( 50 \mathrm { ~W } , \mathrm { H } ^ { + } \)form)를 이용해 중화하고 여과하였다. 각 여과액을 감압농축한 후, EtOAc ( \( \mathrm { 3mL } ) \) 와 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } ( \mathrm { ~3mL } ) \) 로 분획하였다. EtOAc 분획물 \( 2000 \mathrm { ppm } \) 을 syringe filter \( (0.2,13 \mathrm { ~mm } ) \) 로 여과한 후, 여과액은 \( \mathrm { GC } - \mathrm { MS } \) 분석 전까지 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 보관하였다.</p> <h2>GC/MS 분석</h2> <p>GC/MS 분석에는 DB- 5 column \( (0.25 \mu \mathrm { m } \) film diameter \( \times 0.25 \) \( \mathrm { mm } \) diameter \( \times 30 \mathrm { ~m } \) length)를 사용하였다. 운반 기체인 Helium을 \( 24.2 \mathrm { ~mL } / \mathrm { min } \) 의 유속으로 흘려주고, 오븐의 온도는 \( 160 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 에서 \( 320 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 까지 \( 4 ^ {\circ } \mathrm { C } / \mathrm { min } \) 로 15 분 동안 변화를 주었다. 인젝터와 검출기의 온도는 \( 280 ^ {\circ } \mathrm { C } \) 로 동일하게 설정하였다. 시료 용액 \( (1 \mu \mathrm { L } ) \)을 10:1의 split ratio로 \( \mathrm { GC } \) column에 주사하였다. 검출기로는 전자 이온화(electron ionization; \( \mathrm { EI } )(70 \mathrm { ~eV } ) \) 와 사중극자 (quadrupole) 질량분석기를 사용하였다. 지방산은 순수 지방산의 보유시간과 질량 분광학적으로 비교하여 동정하였다.</p>	[ "Glycosyl glyceride 1과 2의 알칼리 가수분해를 위해 KOH/MeOH 농도 20%로 녹여 80\\(^\\circ \\mathrm{C}\\)의 항온 수조에 60분 동안 방치한 후, TLC로 초기 물질의 소멸 양상을 관측하고 산성 양이온 교환수지를 이용해 CHCl3-EtOH = 7:1로 중화하고 여과한 후 GC/MS 분석을 통해 지방산을 동정하였다." ]
55e-0c9-4b19211b-5297-43f9-9d3f-ecc6ff7ed5dd	생명LA	국화 ‘백마’(Chrysanthemum morifolium ) 줄기로부터 glycosyl glyceride 의 분리 및 동정	<p>화합물 1 ((2S)-1-O- \( \beta \)-D-galactopyranosyl-2,3-dilinoleoyl glycerol): 연황색 오일 \( \left(\mathrm{CH}_{3} \mathrm{OH}\right) ; \quad[\alpha]_{\mathrm{D}}^{25}+26.0^{\circ}(c=0.10, \mathrm{MeOH}) ; \) negative FAB-mass spectrometry (MS) \( m / z \quad 777[\mathrm{M}-]^{-} \); infrared spectro-scopy (IR) \( (\mathrm{KBr}, \mu) 3383,1723,1612 \mathrm{~cm}^{-1} ;{ }^{1} \mathrm{H} \)-nuclear magnetic resonance (NMR) (\(400 \mathrm{MHz}\), \( \left.\mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD}, \delta_{\mathrm{H}}\right) 5.40-5.30 \) (\(8\mathrm{H}\), overlapped, H-9",9"',10",10"',12",12"',13",13"'), \( 5.30 \) (1H, m, H-2), \( 4.46(1 \mathrm{H}, \mathrm{dd}, J=10.8,2.8, \quad \mathrm{H}-3 \mathrm{a}), 4.24(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=8.0 \), \( \left.\mathrm{H}^{\prime} 1^{\prime}\right), 4.18(1 \mathrm{H}, \quad \mathrm{dd}, \quad J=10.8,6.8, \quad \mathrm{H}-3 \mathrm{~b}), 3.86 \) (1H, dd, \( J=10.4,5.4 \), H-1a), \( 3.79\left(1 \mathrm{H}, \mathrm{m}, \mathrm{H}-4^{\prime}\right), 3.75 \) (1H, m, H-\( \left.5^{\prime}\right), 3.71 \) (2H, overlapped, \( \left.\mathrm{H}^{\prime}-6^{\prime}\right), 3.64 \) (1H, dd, \( J=10.4,6.0 \), H-1b), \( 3.49 \) (1H, overlapped, H-2',3'), \( 2.80 \) (4H, overlapped, \( \mathrm{H}-11,11), 2.32 \) (2H, overlapped, \( \mathrm{H}-2), 2.31 \) (2H, overlapped, \( \mathrm{H}-2), \quad 2.06 \quad\left(8 \mathrm{H}, \quad\right. \) overlapped, \( \left.\mathrm{H}-8^{\prime \prime}, 8^{\prime \prime \prime}, 14 ", 144^{\prime \prime}\right), \quad 1.59 \quad(4 \mathrm{H} \), overlapped, \( \mathrm{H}-3,3), 1.32-1.26(28 \mathrm{H} \), overlapped, \( \mathrm{H}-4-7,4-7 \), \( \left.15-17, \quad 15-17^{\prime \prime \prime}\right), \quad 0.97 \quad\left(6 \mathrm{H}, \quad \mathrm{t}, \quad J=8.0, \quad \mathrm{H}-18^{\prime \prime}, 18^{\prime \prime}\right) ; \quad{ }^{13} \mathrm{C}-\mathrm{NMR} \) \( \left(100 \mathrm{MHz}, \quad \mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD}, \quad \delta_{\mathrm{C}}\right) 175.5 \) (C-1"), \( 175.3 \) (C-1"'), \( 131.1 \) \( \left(\mathrm{C}-9\right. \) "), \( 131.0 \quad\left(\mathrm{C}-9^{\prime \prime}\right), \quad 129.2 \quad\left(\mathrm{C}-12^{\prime \prime}, 12^{\prime \prime \prime}, 13^{\prime \prime}, 13^{\prime \prime}\right), 128.8 \quad(\mathrm{C}- \) \( \left.10^{\prime \prime}, 10^{\prime \prime \prime}\right), \quad 105.2\left(\mathrm{C}-1^{\prime}\right), 74.7 \quad\left(\mathrm{C}-3^{\prime}\right), 74.4\left(\mathrm{C}-5^{\prime}\right), 72.3 \) (C-2'), \( 71.7(\mathrm{C}-2), 70.2\left(\mathrm{C}-4^{\prime}\right), 67.7(\mathrm{C}-1), 66.2(\mathrm{C}-3), 62.2 \) (C-6'), \( 35.1\left(\mathrm{C}-2^{\prime \prime}\right), 34.9\left(\mathrm{C}-2^{\prime \prime}\right), 33.1\left(\mathrm{C}-14^{\prime \prime}, 14^{\prime \prime \prime}\right), 30.7-30.2 \) (C-4"-7",4"'-7"',15"-17", \( 15^{\prime \prime \prime}-17 \) "'"), \( 28.1 \quad(\mathrm{C}-8,8), 26.4(\mathrm{C}-11,11), 26.0 \) \( (\mathrm{C}-3,3), 14.7(\mathrm{C}-18,18) ; \mathrm{GC}-\mathrm{MS} \mathrm{t}_{\mathrm{R}}=12.96 \) min (linoleic acid methyl ester).</p><p>화합물 \(2\) ((2S)-1-O- \( \beta \)-D-galactopyranosyl-2,3-dipalmitoyl glycerol): 연녹색 오일 \( \left(\mathrm{CH}_{3} \mathrm{OH}\right) ;[\alpha]_{\mathrm{D}}^{25}+26.4^{\circ}(c=0.10, \mathrm{MeOH}) \); positive FAB-MS \( m / z 731[\mathrm{M}+\mathrm{H}]^{+} ; \quad \mathrm{IR}(\mathrm{KBr}, \mu) 3383,1723 \mathrm{~cm}^{-1} \); \( { }^{1} \mathrm{H}-\mathrm{NMR}\left(400 \mathrm{MHz}, \mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD}, \delta_{\mathrm{H}}\right) ; 5.30(1 \mathrm{H}, \mathrm{m}, \mathrm{H}-2), 4.46 \) \( (1 \mathrm{H}, \mathrm{dd}, J=10.4,2.8 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-3 \mathrm{a}), 4.23(1 \mathrm{H}, \mathrm{d}, J=8.0 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}- \) 1'), \( 4.18(1 \mathrm{H}, \mathrm{dd}, J=10.4,6.8 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-3 \mathrm{~b}), 3.86(1 \mathrm{H}, \mathrm{dd} \), \( J=10.2,4.2 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-1 \mathrm{a}), 3.79(1 \mathrm{H}, \mathrm{m}, \mathrm{H}-4 \) ) \( ) 3.75(1 \mathrm{H}, \mathrm{m} \),\( \left.\mathrm{H}-5^{\prime}\right), 3.71\left(2 \mathrm{H}\right. \), overlapped, \( \left.\mathrm{H}-6^{\prime}\right), 3.64 \) (1H, dd, \( J=10.2 \),\( 6.0 \mathrm{~Hz}, \mathrm{H}-\mathrm{lb}), 3.50 \) (2H, overlapped, \( \left.\mathrm{H}-2^{\prime}, 3^{\prime}\right), 2.32(2 \mathrm{H} \), overlapped, H-2"), \( 2.31 \) (2H, overlapped, H-2"'), \( 1.59 \) (4H, overlapped, \( \left.\mathrm{H}-3^{\prime \prime}, 3^{\prime \prime}\right) \), 1.34-1.25 (48H, overlapped, H-4"-15", H-4"'-15"'), \( 0.89 \) (6H, t, \( J=8.0, \quad \mathrm{H}-16 ", 16 " 16) ;{ }^{13} \mathrm{C}-\mathrm{NMR} \) (100\( \left.\mathrm{MHz}, \mathrm{CD}_{3} \mathrm{OD}, \delta_{\mathrm{C}}\right) 175.7 \) (C-1"), \( 175.3 \) (C-1"'), 105.2 (C-1'), 74.7 (C-3'), 74.4 (C-5'), \( 72.3 \) (C-2'), \( 71.7 \) (C-2), \( 70.2 \) (C-4'), 67.7 (C-1), 66.2 (C-3), 62.2 (C-6'), 34.9 (C-2"), 34.8 (C-2"'), 33.1 (C-14",14"'), 30.8-30.1 (C-4"-13",4"'-13"'), 26.0 (C-3",3"'), 23.7(C-15",15"'), 14.4 (C-16",16"'); GC-MS \(\mathrm{t}_{\mathrm{R}}=11.06 \) min (palmitic acid).</p>	[ "본 논문에서는 연황색 오일인 (2S)-1-O- \\( \\beta \\)-D-galactopyranosyl-2,3-dilinoleoyl glycerol과 연녹색 오일인 (2S)-1-O- \\( \\beta \\)-D-galactopyranosyl-2,3-dipalmitoyl glycerol를 소개한다." ]
55e-0c9-2da83a72-2835-4999-ad14-c3422404808a	생명LA	CCD-\(986\)sk 세포내에서의 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 주름개선 효과	<h1>서 론</h1> <p>피부 노화는 내인성 노화와 외인성 노화로 구분되며 외인성 노화 중 자외선에 의한 노화를 광노화(photoaging)라고 한다(Jenkins 2002). 광노화의 원인인 자외선은 피부세포 내에 유해한 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성시키며 이러한 활성 산소종은 피부 결합조직을 구성하는 콜라겐, 엘라스틴 등과 같은 세포 외 기질 단백질의 합성을 줄이고, 구조 변형 및 탄력 감소에 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다 (Fisher 등, 2002; Kim 등, 2010). 또한 자외선은 activating protein-1 (AP-1)을 활성화 시키며, 활성화된 \( \mathrm{AP}-1 \)은 matrix metalloproteinase (MMPs)의 발현을 유도하여 광노화를 촉진시킨다(Oh 등, 2006; Soter 1990). 인체 진피 섬유아세포에 자외선을 조사하면 MMP-1 및 MMP-3 발현이 증가하는 것이 보고되어 있으며(Kim 등, 2013), 이 중 MMP-1은 collagenase 1으로 알려져 있으며, 콜라겐 type I과 III를 기질로 하고 있다(Wang 등, 1999). 따라서 피부 주름 예방을 위해서는 섬유아세 포내에서의 세포외기질 분해효소인 \( \mathrm{MMP} \)의 작용을 억제시키고 collagen 합성을 증가시키는 것이 필요하다.</p> <p>노랑어리연꽃(Nymphoides peltata (J.GGmelin) Kuntze)은 유라시아에 자생하는 조름나물과(Menyanthaceae)의 다년생 수생 식물로 잎은 마주 나며 꽃은 밝은 황색으로 7-9월에 핀다. 전초를 행채(㕉芽)라고 하며, 청열, 이뇨, 소종, 해독의 효능이 있다(Bae 2000). Nymphoides 속은 전세계적으로 생물학적 특징에 따라 분류되어 약 50 여종이 보고되어 있으며(Tippery 등, 2009), 우리나라는 노랑어리연꽃, 어리연꽃 \( (N \) indica (L.) Kuntze) 및 좀어리연꽃( \( N \). coreana (Lev.) Hara) 3종이 자생한다(Lee 등, 2011). 어리연꽃은 예부터 민간요법으로 이질, 옴, 뱀독, 황달, 해열, 항경련 등의 치료 악물로서 널리 이용되어 왔으며, 최근 iridoid, flavonoid, terpenoid 등의 성분 연구 및 이에 대한 항균 , 항원충, 항당화 등의 효과가 보고된 바 있다(Amin 2016). 하지만 어리연꽃의 다양한 생리활성 연구에 비교하여 동속 식물인 노랑어리연꽃에 대한 효능 및 활용 연구는 미미한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 노랑어리연꽃 추출물 및 극성에 따른 용매 분획물의 주름개선 활성을 평가하여 천연 항노화 소재로서의 가치를 검토하고, 향후 노랑어리연꽃의 다양한 화장품 소재로서의 활용에 기초자료를 제시하고자 한다.</p>	[ "본 논문에서는 자외선이 AP-1을 활성화시켜 MMPs의 발현을 유도해 진행되는 광노화를 설명하고, 이러한 피부 주름 예방을 위해서는 섬유아세 포내에서의 세포외기질 분해효소인 \\( \\mathrm{MMP} \\)의 작용을 제어하고 collagen 합성을 증가시켜야 한다고 설명한다. 이에 노랑어리연꽃 추출물 및 극성에 따른 용매 분획물의 주름개선 활성을 연구했으며, 천연 항노화 소재로서의 가치를 검증하고 향후 화장품 소재로서의 활용에 기초자료로 활용할 가능성을 시사했다." ]
55e-0c9-fc4cee8e-b228-4fbe-ab74-067666ecd031_01	생명LA	CCD-\(986\)sk 세포내에서의 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 주름개선 효과	<h2>ROS (Reactive Oxygen Species) 생성량 측정</h2> <p>CCD-986sk 세포를 배양한 후 96 well white plate에 \( 2 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 접종하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 PBS로 교체한 후 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \)을 조사 한 뒤, 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 \( 5,10,25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 희석하여 처리한 후 24시간 배양 하였다. 그 후 제조사의 매뉴얼에 따라 ROS Glo \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) assay를 수행하였다.</p> <h2>Pro-collagen 합성 및 MMP-1 발현 측정</h2> <p>CCD-986sk 세포를 배양한 후 6 well plate에 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 접종하고 24시간 배양하였다. 24시간 후 배지를 제거하고 PBS \( 1 \mathrm { ~mL } \)을 첨가하여 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \)를 조사한 뒤, \( \mathrm { PBS } \)를 제거하고 \( 10 \% \) FBS와 \( 1 \% \) penicillin streptomycin이 들어 있지 않은 DMEM 배지로 교체한 후 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 \( 5,10,25 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } \) 희석하여 처리하여 48시간 배양하였다. 상등액을 취하여 pro-collagen과 MMP-1을 각 kit사의 protocol에 따라 실험을 진행한 뒤, microplate reader로 \( 450 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p> <h2>Pro-collagen 및 MMP-1 단백질 발현 측정</h2> <p>CCD-986sk 세포를 \( 1 \times 10 ^ { 5 } \) cells/well로 6 well plate에 분주하여 24시간 배양한 후에 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \)를 조사한 뒤 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 농도별로 처리하여 48시간 배양하였다. 세포를 RIPA buffer (Pierce, Appleton, WI, USA)로 용해하고 원심분리한 후 얻은 상층액을 BCA protein assay (Pierce, Appleton, WI, USA)로 protein을 \( 20 \mu \mathrm { g } \)의 농도로 정량하였다. 준비된 protein sample은 \( 10 \% \) SDS-PAGE를 이용해 전기영동하고 PVDF membrane으로 transfer 시킨 뒤, 5 \% skim milk가 함유된 tris 완충용액으로 1시간 blocking 한 후, pro-collagen, \( \mathrm { MMP } -1, \beta \)-actin 각각의 1차 및 2차 항체와 반응시켰다. 반응 후 Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate(Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 5분간 반응시킨 후 Chemi-Doc을 이용하여 현상하였다.</p> <h2>Pro-collagen 및 MMP-1 mRNA 발현 측정</h2> <p>노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 pro-collagen 및 MMP-1 mRNA 발현에 미치는 영향을 보기 위하여 CCD-986sk 세포를 6 well에 \( 5 \times 10 ^ { 5 } \mathrm { cells } / \) well에 되도록 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 UVB \( \left (20 \mathrm { ~mJ } / \mathrm { cm } ^ { 2 } \right ) \)를 조사한 뒤, 시료를 농도별로 처리한 배지로 교환하고 48시간 동안 배양하였다. 48시간 후 cold PBS로 세척한 뒤, trizol reagent (Biosesang, Seongnam, Korea)을 이용하여 분리하였다. Total RNA \( 1 \mu \mathrm { g } \)과 PCR primer oligonucleotide를 RT-PCR mixer와 혼합하고 RT-PCR을 시행하였다. Pro-collagen (forward, CTCCAACGAGAT CGAGATC and reverse, GTTACAGGAA GCAGACAGG)과 MMP-1 (forward, AAAGGG AATAAGTACTGGGC and reverse, AATTCCAGGAAAG TCATGTG)을 이용하여 RT-PCR을 실시하였으며, 조건은 \( 94 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 30초(denaturation), \( 50 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 5초 (annealing), \( 72 { } ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 90초(extension)의 반응을 30-35회 반복 하는 것을 기본으로 target cDNA 종류에 따라 최적의 조건으로 조절하였다. 증폭된 \( \mathrm { cDNA } \)는 \( 1.25 \% \) agarose gel을 사용한 전기영동으로 분리하고 Gel-doc으로 확인하였다.</p> <h2>통계처리</h2> <p>본 실험의 통계처리는 SPSS \( 12.0 \)을 사용하였다. 각 실험군의 결과는 평균치와 표준편차로 나타내었으며, 각 실험군의 간의 결과는 2-표본 \( \mathrm { t } \) 검정을 사용하여 분석하고 유의적인 차이가 있는 항목에 대해서만 검정하였다. 실험군 간의 차이는 \( 95 \% \) 수 준 \( \left ( * p<0.01, { } ^ { * * } p<0.001 \right ) \)에서 유의성 있는 것으로 하였다.</p>	[ "CCD-986sk 세포를 배양한 후 96 well white plate에 \\( 2 \\times 10 ^ { 5 } \\) cells/well로 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 ROS Glo \\( \\mathrm { H } _ { 2 } \\mathrm { O } _ { 2 } \\) assay를 제조사의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 또한, CCD-986sk 세포를 배양한 후 6 well plate에 \\( 1 \\times 10 ^ { 5 } \\) cells/well로 접종하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 UVB \\( \\left (20 \\mathrm { ~mJ } / \\mathrm { cm } ^ { 2 } \\right ) \\)를 조사하고, 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 농도별로 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 또한, 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물이 pro-collagen 및 MMP-1 mRNA의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 CCD-986sk 세포를 6 well plate에 \\( 5 \\times 10 ^ { 5 } \\) cells/well로 배양하여 24시간 동안 관찰하였다." ]
55e-0c9-fc4cee8e-b228-4fbe-ab74-067666ecd031_00	생명LA	CCD-\(986\)sk 세포내에서의 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 주름개선 효과	<h1>재료 밎 방법</h1> <h2>재료 및 추출</h2> <p>본 실험에 사용된 노랑어리연꽃은 국내산으로 광주광역시에 소재한 농업회사법인 (주)로터스그린에서 2015년 11월 구매하여 사용하였으며, 국립생물자원관 생물자원연구부 식물자원과의 확증표본(NIBRVP000012545)으로 생물 종 판별 시스템에 의해 확인되었다. 노랑어리연꽃의 전초는 음건한 후 건조 시료 \( 200 \mathrm { ~g } \)을 실온에서 methyl alcohol \( ( \mathrm { MeOH } ) \) 에 3일 동안 침지시키고 이 과정을 3회 반복하여 농축 후 동결 건조하여 추출물 \( 21.5 \mathrm { ~g } \)을 얻었다. 노랑어리연꽃 추출물(16.4 g)은 증류수로 용해하고 유기 용매의 극성에 따라 \( n \)-hexane (Hex), methylene chloride (MC), ethyl aceate (EA) 및 \( n \)-butyl alcohol ( \( \mathrm { BuOH } ) \)을 순차적으로 가하여 각 분획물 \( (0.8,0.7,1.1,2.4 \mathrm { ~g } ) \)을 얻었다.</p> <h2>시약 및 기기</h2> <p>세포 독성 실험 및 배양을 위한 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5diphenyl-tetrazolium bromide(MTT)는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA), Dulbeco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS) 및 Penecillin Streptomycin (100X)는 Hyclone (Logan, UT, USA) 제품을 사용하였다. 유효성 평가를 위한 MMP-1, Pro-COL1A1, \( \beta \)-actin 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)에서 구입하여 사용하였으며, ROS-Glo \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) Go Script \( ^ {\mathrm { TM } } \) Reverse Trans-criptase, GoTaq \( { } ^ { Ⓡ } \) Flexi DNA Polymerase는 Promega(Madison, WI, USA) 제품을 MMP-1, Pro-collagen kit는 각각 Abcam (Cambridge, MA, USA), TaKaRa (Shiga, Japan)에서 구입하여 사용하였다. 본 실험에 사용된 microplate reader 장비는 Spectrostar Nano(BGM LabTech, Ortenberg, Germany)를 사용하였으며, Chemi-Doc은 LAS4000(Fuji Film, Tokyo, Japan) 제품을 사용하였다.</p> <h2>세포배양 및 세포 생존율 측정</h2> <p>\( \mathrm { ATCC } \)에서 구매한 CCD-986sk (Human fibroblast) 세포를 \( 10 \% \) FBS, \( 1 \% \) penicillin streptomycin을 첨가한 DMEM으로 배양기에서 \( 37 ^ {\circ } \mathrm { C } , 5 \% \mathrm { CO } _ { 2 } \)조건으로 배양하였다. 본 실험에서 CCD-986sk 세포에 대한 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 유효농도를 결정하기 위해 세포생존율 측정은 MTT assay로 진행하였다. 배양된 CCD-986sk 세포를 48 well plate에 각각 \( 5 \times 10 ^ { 3 } \) cells/well로 접종하고 24시간 배양하였다. 동일 배지로 교체한 후 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물을 농도별 \( (5,10,25,50,75,100 \mu \mathrm { g } / \mathrm { mL } ) \)로 희석하여 처리한 후 48시간 \( \mathrm { CO } _ { 2 } \) incubator에서 배양하였다. \( 5 \mathrm { mg } / \mathrm { mL } \) \( \mathrm { MTT } \) 용액을 배양된 세포에 \( 20 \mu \mathrm { L } \) 씩 처리한 후 4시간 반응시켰다. 그 후 demethyl sulfoxide \( 100 \mu \mathrm { L } \) 넣은 후, 10분간 교반한 후 microplate reader로 \( 540 \mathrm { ~nm } \)에서 흡광도를 측정하였다.</p>	[ "실험에 사용된 노랑어리연꽃은 국내산으로 (주)로터스그린에서 2015년 11월에 구매되었다. 이 식물은 국립생물자원관 생물자원연구부의 확증표본을 통해 종 판별 시스템에 의해 확인되었다. 실험에는 Spectrostar Nano(BGM LabTech, Ortenberg, Germany)라는 microplate reader 장비와 LAS4000(Fuji Film, Tokyo, Japan) 제품인 Chemi-Doc이 사용되었다. CCD-986sk 세포에 대한 노랑어리연꽃 추출물 및 분획물의 유효농도 결정을 위해 MTT assay를 사용하여 세포 생존율을 측정하였다." ]
55e-0c9-4cc41844-0b24-4f9d-8f1d-9b3c84c737bb_00	생명LA	황금(Scutellaria baicalensis) 유효분획물 제조의 합리적이고 효율적인 접근방법	<h2>단일화합물 분리 및 구조분석</h2> <p>황금추출물에서 활성유도분획법을 위해 11개의 칼럼분획물들(SB Frs. 1-10)을 준비하여 MG53-IRS-1 결합 억제(MID, MG53-IRS-1 dissociator) 스크리닝을 통해 가장 우수한 SB Fr. 10번 칼럼분획물을 확인하였다(data not shown). SB Fr. 10번을 대량 확보 가능한 합리적이고 효율적인 방법인 개방형칼럼 분취 방법으로 확보된 표준 유효분획물을 prep-HPLC에 Waters Atlantis T3 칼럼을 사용하여 증류수(A), MeOH (B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \) MeOH, \(5-30 \mathrm { min } \) \(100 \% \) MeOH, \(30-35 \mathrm { min } \) \(100 \% \) MeOH, \(35-36 \mathrm { min } \) \(50 \% \) MeOH, \(36-46 \mathrm { min } \) \(50 \% \) MeOH 조건으로 세부 분획물(SB Frs. 10-1 10-6)을 반복하여 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 지표성분들을 분리하고자 하였다. SB Fr. 10-2를 prep-HPLC에 Acclaim \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) polar advantage II (PAII) 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN(B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \( 50 \% \) (B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(50-55 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B) 조건으로 SB Fr. 10-2-1 (5, skullcapflavone II, \(31.0 \mathrm { mg } \) ), SB Fr. 10-2-2 (1, 5,7,2'-trihydroxy-8-methoxyflavone, \(30.0 \mathrm { mg } ) \) 를 분리하였다. SB Fr. 10-3을 prep-HPLC에 Acclaim \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) PAII 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN (B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(50-55 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B) 조건으로 SB Fr. 10-3-1 (7, dihydrooroxylin A, \(16.0 \mathrm { mg } \)), SB Fr. 10-3-2 (2, wogonin, \( 30.0 \mathrm { mg } \) ), SB Fr. 10-3-3 (1, 5,7,2'-trihydroxy-8-methoxyflavone, \(5.0 \mathrm { mg } \) 를 분리하였다. SB Fr. 10-4을 prep-HPLC에 Acclaim \( { } ^ {\mathrm { TM } } \) PAII 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN (B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(50-55 \mathrm { min } \)) \(75 \% \) (B), \( 55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B) 조건으로 SB Fr. 10-3-1 (7, dihydrooroxylin A, 16.0 mg), SB Fr. 10-3-2 (2, wogonin, \(30.0 \mathrm { mg } \) ), SB Fr. 10-3-3 (1, 5,7,2'-trihydroxy-8-methoxyflavone, \(5.0 \mathrm { mg } ) \) 를 분리하였다. SB Fr. 10-4을 prep-HPLC에 Acclaim \( ^ {\mathrm { MM } } \) PAII 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN(B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \(50-55 \mathrm { min } \) \(75 \% \) (B), \( 55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \) (B) 조건으로 SB Fr. 10-4-1 (4, 5,7-dihydroxy-6,8-dimethoxyflavone, \(18.0 \mathrm { mg } \) ), SB Fr. 10-4-2 (2, wogonin, \( 33.0 \mathrm { mg } \) )를 분리하였다. SB Fr. 10-5을 prep-HPLC에 Acclaim \( ^ {\mathrm { TM } } \) PAII 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN(B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \)(B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \)(B), \(50-55 \mathrm { min } \) \(75 \% \)(B), \( 55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \)(B) 조건으로 SB Fr. 10-5-1 (6, oroxylin A, \(20.0 \mathrm { mg } \) ), SB Fr. 10-5-2 (3, 5,7-dihydroxy-flavone, \(2.0 \mathrm { mg } \) 를 분리하였다. SB Fr. 10-6을 prep-HPLC에 Acclaim \( ^ {\mathrm { TM } } \) PAII 칼럼을 사용하여 증류수(A), ACN (B)의 혼합 용매를 이동상으로 하는 \(0-5 \mathrm { min } \) \(50 \% \)(B), \(5-50 \mathrm { min } \) \(75 \% \)(B), \(50-55 \mathrm { min } \) \(75 \% \)(B), \(55-57 \mathrm { min } \) \(50 \% \)(B) 조건으로 SB Fr. 10-6-1 (6, oroxylin A, \( 27.0 \mathrm { mg } ) \), SB Fr. 10-6-2 (8, 5,2'-dihydroxy-6,7,8-trimethoxyflavone, \(12.6 \mathrm { mg } \) )를 분리하였다. 순수하게 분리정제한 생리활성물질의 구조를 동정하기 위하여 NMR, MS, UV 등의 분광학적인 기기를 사용하였다. 먼저, \( { } ^ { 1 } \mathrm { H } - { } ^ { 13 } \mathrm { C } - \mathrm { NMR } \) 에서 수소와 탄소의 개수와 chemical shift 값으로 기본적인 골격을 예상하였고, 2D-NMR (COSY, HMQC, HMBC, DEPT)에서 수소-탄소의 연관관계를 통해 치환기의 정확한 위치와 탄소 차수를 확인하여 물질의 구조를 확인하였고 선행문헌의 화합물들을 확인하여 구조를 결정하였다.</p>	[ "활성유도분획법을 목적으로 황금추출물에서 11개의 분획물들을 준비하여 MG53-IRS-1 결합 억제 스크리닝을 사용하여 우수한 분획물을 가려내었다. 실험에서 실시한 단일화합물 분리 및 구조분석은 다음과 같이 진행하였다. 또한 개방형칼럼 분취 방법으로 확보된 표준 유효분획물을 prep-HPLC에 Waters Atlantis T3 칼럼을 사용하여 분석하고, MeOH 조건으로 세부 분획물을 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 지표성분들을 분리한 후에 NMR, MS, UV 등의 분광학적인 기기로 생리활성물질의 구조를 분석하였다. 특히 2D-NMR에서 수소-탄소의 관계를 통해서 치환기의 정확한 위치와 탄소 차수와 물질의 구조를 확인하고 구조를 결정하였다." ]
55e-0c9-4cc41844-0b24-4f9d-8f1d-9b3c84c737bb_03	생명LA	황금(Scutellaria baicalensis) 유효분획물 제조의 합리적이고 효율적인 접근방법	<h2>Pack 3 (5,7-dihydroxyflavone)</h2> <p>노란색 분말, HRESIMS \( m / z=255.0650[ \mathrm { M } + \mathrm { H } ] ^ { + } \)(calcd for \( \left . \mathrm { C } _ { 15 } \mathrm { H } _ { 11 } \mathrm { O } _ { 4 } , 255.0657 \right ), \lambda_ {\max } ( \mathrm { MeOH } ) 268,313 \mathrm { ~nm } \).</p> <h2>Peak 4 (5,7-dihydroxy-6,8-dimethoxyflavone)</h2> <p>노란색 분말, HRESIMS \( m / z=315.0868 \left [ \mathrm { M } + \mathrm { H } ^ { + } \right ] \)(calcd for \( \left . \mathrm { C } _ { 17 } \mathrm { H } _ { 15 } \mathrm { O } _ { 6 } , 315.0869 \right ) \), \( \lambda_ {\max } ( \mathrm { MeOH } ) 278,320 \mathrm { ~nm } . { } ^ { 1 } \mathrm { H } - \mathrm { NMR } \) \( \left (700 \mathrm { MHz } \right . \mathrm { DMSO-d } \left .d_ { 6 } \right ) \delta_ {\mathrm { H } } \) \(6.94 (1 \mathrm { H } . \mathrm { s } , \mathrm { H-3 } ) \), \( 8.05(1 \mathrm { H } , \mathrm { dd } , \left .J=6.4,1.6 \mathrm { ~Hz } , \mathrm { H } -2 ^ {\prime } , 6 ^ {\prime } \right ) \), \(7.59 \left (3 \mathrm { H } , \mathrm { m } , \mathrm { H } -3 ^ {\prime } , 5 ^ {\prime } \right ) \), \(3.86(3 \mathrm { H } , \mathrm { s } , \mathrm { 8-OCH } \left . { } _ { 3 } \right ) \), \(3.76 \left (3 \mathrm { H } , \mathrm { s } , 6- \mathrm { OCH } _ { 3 } \right ) \), \(12.6 ( \mathrm { 1H } , \mathrm { s } , \mathrm { 5-OH } ) \); \( { } ^ { 13 } \mathrm { C } - \mathrm { NMR } \left (175 \mathrm { MHz } , \mathrm { DMSO } -d_ { 6 } \right ) \delta_ {\mathrm { C } } 162.6( \mathrm { C } -2) \), \(102.3( \mathrm { C } - 3) \), \( 182.0( \mathrm { C } -4) \), \( 148.4 ( \mathrm { C } -5) \), \( 132.0 ( \mathrm { C } -6) \), \( 145.7 ( \mathrm { C } -7) \), \( 131.0( \mathrm { C } -8) \), \( 151.3 ( \mathrm { C } -9) \), \( 104.6 ( \mathrm { C } -10) \), \( 132.0 ( \mathrm { C } -1') \), \( 126.2 ( \mathrm { C } -2') \), \( 129.3 ( \mathrm { C } -3') \), \( 128.4 \left ( \mathrm { C } -4 ^ {\prime } \right ) \), \(129.3 \left ( \mathrm { C } -5 ^ {\prime } \right ) \), \(126.2 (C-6) \), \( 61.1 \left (8- \mathrm { OCH } _ { 3 } \right ) \), \(60.0 \left (6- \mathrm { OCH } _ { 3 } \right ) \).</p>	[ "5,7-dihydroxyflavone로 구성된 Pack 3과 5,7-dihydroxy-6,8-dimethoxyflavone로 이루어진 Peak 4은 모두 노란색 분말이다. Pack 3의 경우에는 \\( \\mathrm { MeOH }\\) 의 작용기로 인한 268,313 \\(\\mathrm { ~nm }\\) 에서의 피크를, Peak 4에서는 278,320 \\(\\mathrm { ~nm }\\) 피크를 확인할 수 있다." ]
55e-0c9-cc402bde-8b05-4084-ac06-16dd9aa9cceb	생명LA	박테리오파지 저항성을 갖는 Pseudomonas tolaasii 변이주 분리 및 이들의 병원특성	<h1>결 과</h1> <h2>파지저항성 균주의 분리</h2> <p>본 연구에서는 느타리비섯 재배 시 큰 피해를 유발하는 세균성 갈반병의 방제를 위하여, 사용이 금지된 농약이나 항생제 대신에 숙주균에 특이적이며 사멸효과가 큰 박테리오파지를 이용하여 친환경적인 파지테라피 방법을 개발하고자 하였다. 갈반병 등을 유발한 균주들을 재배농가에서 분리하여 \( 16 \mathrm{~S} r \) RNA 유전자 분석을 통하여 동정하였고, 이들 중 병원균인 Pseudomonas tolaasi에 속하는 균주 총 23종을 동정하였으며, 이들을 P1그릅으로 명명하였다. 또한, 이들을 다시 phylogenetic tree 분석을 통하여 크게 3종류로 분류하여 \( \mathrm{P} 1 \alpha, \mathrm{P} 1 \beta, \mathrm{P} 1 \gamma \)로 명령하였다 (Yun 등, 2013). 갈반병이 발생한 농가에서 수집한 병원성 균주를 숙주균으로 이용하여 특이적인 박테리오파지를 분리하였고, 파지의 숙주균 사멸활성은 수주균의 배지에 파지를 감염시켰을 때, 파지의 감염으로 숙주균이 사멸되어 나타나는 투명한 용균반(plaque)의 형성으로 확인하였다. 파지의 숙주균에 대한 독성에 따라 12시간 이상 배양하였을 때, 파지에 의한 용균반 형성과 용균반의 크기나 투명도가 다르게 나타났다(Kim 등, 2011).</p> <p>병원성 숙주균에 대한 파지의 독성실험 중 2일 이상 배양하는 경우 시간의 경과에 따라서 투명했던 용균반 내부에 자주 세균의 성장이 관측되었으며, 새로이 나타난 세균은 용균반을 만든 파지에 감염되지 않거나 파지의 감염에 둔감한 파지-저항성 균주인 것으로 확인하였다. 용균반 관측실험은 숙주균과 파지를 제외하고 무균 조건에서 수행되었기에 새로이 용균반 내에서 나타난 균주는 원래의 숙주균이 파지에 대하여 저항성을 획득함으로써 나타난 것으로 수정하고, 이 균주들을 분리하여 특성을 조사하였다. 균주의 분리는 고체배지의 상부에 반고체배지를 만들고 파지를 접종하여 용균반을 생성시킨 후, 용균반 내부에서 성장하는 세균의 콜로니를 분리하여 얻었다(Fig. 1).</p> <p>파지저항성 균주는 용균반 내부에 불투명한 균주성장반을 형성하거나, 다수의 콜로니 형태로 나타났다. 먼저, P. tolaasii 균주 중 Pl \( \alpha \) 세분류에 속하는 숙주균인 P. tolaasii 6264와\( \mathrm{HK}^{2}, \mathrm{HK}_{4}, \mathrm{HK} 5 \)에 각각의 특이적 파지인 \( \phi \mathrm6264\), \( \phi \mathrm{HK} 2 \), \( \phi \mathrm{HK} 3, \phi \mathrm{HK} 4, \phi \mathrm{HK} 5 \)를 접종하였고, 다른 세분류 \( \mathrm{P} 1 \beta, \mathrm{P} 1 \gamma \)에 속하는 숙주균 P. tolaasii \( \mathrm{HK} 19 \), P. tolaasii \( \mathrm{HK} 23 \)에 각각 \( \phi \mathrm{HK} 19 \)와 \( \phi \mathrm{HK} 23 \)를 접종하였다. 시간이 경과함에 따라 용균반 내부에서 저항성 균주의 콜로니가 발셍하는 것을 확인하였다 (Fig. 1). 파지 저항성을 획득한 P. tolaasii 6264 균주는 원래의 숙주균과 구별하기 위하여 P. tolaasii 6264R로 명명하였으며, 마찬가지로 파지저항성을 획득한 P. tolaasii \( \mathrm{HK} 2 \)는 P. tolaasii \(\mathrm{HK} 2 \mathrm{R} \)로 나타내, 파지 저항성 균주의 변종번호에 \( \mathrm{R} \)을 가하여 변종을 구별하였다.</p> <p>파지저항성 균주들의 클로니 양태를 관즉하면 P. tolaasii \( 6264 \mathrm{R} \) 균주와 \( \mathrm{HK} 19R\) 균주는 용균반 전체로 퍼져 나타났으며, 저항성균 성장반 주위에는 파지의 확산에 따라 용균반 밖에는 파지감수성 균이, 내부에는 파지저항성 균이 성장하여 퍼지는 상태로 이 사이에는 투병한 용균선이 관측되었다. 그러나, 같은 \( \mathrm{P} 1 \alpha \) 세분류 균주의 파지 감염에서 얻어진 \( \mathrm{HK} 2 \mathrm{R} \) 균주와 \( \mathrm{HK} 3 \mathrm{R}, \mathrm{HK} 4 \mathrm{R}, \mathrm{HK} 5 \mathrm{R} \) 균주들은 저항성균주 성장반을 형성하지 않고 용균반 내부에 다수의 콜로니를 형성하였고, \( \mathrm{P} 1 \gamma \) 세분류 균주의 파지 감염에서 얻어진 \( \mathrm{HK} 23 \mathrm{R} \)은 저항성균주 성장반과 콜로니 형태 두 가지 모두 관측되었다.</p>	[ "본 연구는 느타리버섯 재배에 큰 손해를 주는 세균성 갈반병 방제를 위해, 환경 친화적인 파지테라피 방법을 개발하고자 했다. 갈반병을 유발하는 균주들을 분리해 \\(16S rRNA\\) 유전자 분석을 통해 동정했으며, 특히 Pseudomonas tolaasii에 속하는 23종을 P1그룹으로 분류했다. 또한, 파지의 독성 실험 중에서 파지에 대한 저항성을 가진 균주들이 생겨나는 것을 확인했으며, 이 균주들은 용균반을 만드는 파지에게서 잘 감염되지 않거나 감염에 대한 둔감성을 보였다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-576e-448f-88bb-93af9dad2859_03	생명LA	박테리오파지 저항성을 갖는 Pseudomonas tolaasii 변이주 분리 및 이들의 병원특성	<h2>펩티드독소의 용혈활성 변화여부</h2> <p>갈반병 병원 P. talaasii는 tolaasin을 분비하여 세포독성을 나타내는데, tolaasin은 느타리버섯의 세포에 pore를 형성하여 버섯조직을 파괴하는 펩티드독소이다. 세포독성의 측정은 본래의 숙주균과 파지저항성 균주의 세포독성과 병원성 변화여부를 확인하기 위하여 실시하였다. 파지저항성 균주의 세포독성 측정은 쥐의 적혈구를 이용한 용혈활성 검정법(hcmolysis test)과 양송이버섯을 이용한 버섯함몰 검정법(pitting test)으로 이루어졌다.</p> <p>병원성균주의 용혈활성은 균주가 분비하는 펩티드 독소의 세포독성에 의해 나타나는데, 이것은 독소와 적혈구 세포막 사이의 결합친화도(binding affinity)와, 균주의 생육에 시기에 따른 독소의 분비랑에 의해서도 차이가 난다. 용혈활성의 측정은 취의 적혈구를 독소와 배양하며 배양시긴에 따른 세포의 파괴를 측정하여 이루어졌다(rig. 3). P. tolaasii 6264와 \( \mathrm { HK } 4 \) 배양액을 처리한 경우 모든 적혈구를 용혈시키는데에 각각 40분, 60분이 소요되었지만, 각각의 파지저항성 균주이 \( 6.642 \)과 \( 1 \mathrm { ~K } 4 \mathrm { R } \) 균주는 20분이내에 모든 적혈구를 완전히 용혈시키는 높은 활성을 보여 파지저항성 획득과정중 세포독성이 증가한 것을 알 수 잇었다. 반면, P. tolaasii \( \mathrm { HK } 5 \)와 \( \mathrm { HK } 23 \)의 경우, 숙주균의 세포독성은 매우 크게 나타났으나, 파지저항성 균주의 용혈활성은 완전히 없어져 적혈구의 파괴는 나타나지 않았다. P. tolaasii \( \mathrm { HK } 2, \mathrm { HK } : 7, \mathrm { HK } 3 \) 균주의 경우 파지저항성 획득에 따라 용혈 활성 변화는 관측되지 않아 변화가 없었다. 이상의 결과에서 파지저항성 균주의 세포독성 변화는 균주마다 다른 양상을 보여, 각 균주마다 파지에 대한 저항성을 획득할 때 파지저항성과 무관하게 세포독성 등의 생리생화학적 독성에 변화가 일어났음을 확인하였다.</p> <h2>파지저항성 균주의 갈반형성능</h2> <p>파지저항성 균주의 세포독성 변화 여부를 측정하기 위하여 병원성 균주의 갈반형성 측정법인 비섯조직함몰검정법으로 독성 변화를 확인하였다. 이 검정법은 실제 갈반병이 발셍하는 버섯 조직에 균주의 독소를 처리하여 병원성을 측정하는 방법으로, 버섯 조직의 파괴정도를 측정할 수 있다. Fig. 4에서 P. tolaasii 6264 균주의 경우 파지저항성 획득에 따른 갈반형성능의 변화는 나타나지 않았다. 반면, P. tolaasii HK3와 HI.4 균주는 저항성 획득에 따라 갈반의 깊이가 깊어지고 갈색이 짙어지는 결과로 갈반형성능이 커짐을 확인하였고, P. tolaasii HK5 균주의 경우 저항성 균주에서 갈반형성이 약해져 세포독성이 작아짐을 보였다. 한편, \( \mathrm { HK } 2, \mathrm { HK } 19, \mathrm { HK } 23 \) 균주의 갈반생성은 저항성 획득에 따라 변화가 없었다.</p> <p>버섯함몰 검정법에 따른 측정결과와 용혈활성 측정 결과를 비교하였을 때, \( 6264 ^ {\circ } \). 균주는 용혈활성이 증가하였지만 버섯함몰활성은 변함이 없었고, \( \mathrm { HK } 4 \mathrm { R } \)의 경우에는 용혈활성과 버섯함몰 활성이 모두 증가한 것으로 확인되었다. 또한 용혈활성이 사라진 \( \mathrm { FK } 5 \mathrm { ~K } \) 균주의 비섯함몰 활성이 원래의 P. tolaasii \( \mathrm { HK } 5 \) 균주의 버섯함몰 활성보다 낮아진 것을 볼 수 있었다. 그러나 \( \mathrm { HK } 23 \mathrm { R } \) it \( \mathrm { HK } 3 \mathrm { R } \) 균주의 경우는 용혈활성은 사지거나 작아졌으나 갈반형성능은 원래의 균보다 오히려 증가한 것을 볼 수 있었다. 용혈활성이 없는 P. tolaasii \( \mathrm { HK } 19 \)와 \( \mathrm { HK } 19 \mathrm { R } \) 균주는 비슷한 버섯함몰활성을 가지고 있었다. 이러한 결과는 파지저항성과 용혈활성, 갈반 형성능에 일정한 상관성이 없음을 의미한다.</p>	[ "갈반병 병원 P. talaasii는 펩티드 독소인 tolaasin을 분비해 세포독성을 보이며, 이는 느타리버섯 세포에 pore를 형성해 버섯 조직을 파괴한다. 숙주균과 파지저항성 균주의 세포독성과 병원성 변화를 확인하기 위해 쥐의 적혈구를 이용한 용혈활성 검정법과 양송이버섯을 이용한 버섯함몰 검정법을 사용했다. 병원성 균주의 용혈활성은 펩티드 독소의 세포독성과 독소와 적혈구 세포막 사이의 결합친화도, 그리고 독소의 분비 량에 따라 차이가 나타난다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-576e-448f-88bb-93af9dad2859_00	생명LA	박테리오파지 저항성을 갖는 Pseudomonas tolaasii 변이주 분리 및 이들의 병원특성	<h1>서 론</h1> <p>느타리버섯은 국내 버섯산업에서 생산량과 소비량 모두에서 상위권을 차지하고 있으며, 재배에 따른 고소득이 가능하여 농가에서 선호도가 높은 작물이다. 그럼에도 불구하고 세균성갈반병의 빈번한 발생은 느타리비섯의 재배를 어렵게 하고 있다. 느타리버섯의 갈반병을 예방하기 위하여 농용 지하수를 철저히 살균하거나, 재배사를 훈증소독하고 비닐멀칭이나 봉지, 병을 이용한 재배 방법 등이 다양하게 개발되어 왔음에도 현재까지 효과적인 예방이나 방제방법은 개발되지 못하였고, 발병시에 대책은 없는 실정이다.</p> <p>박테리오파지(bacteriophage)는 바이러스의 한 종류로서, 최근 다양한 항생제에 내성을 가진 세균의 출현에 따라 기존 항생제의 대체방안으로 연구의 중심이 되고 있다(Housby와 Mann 2009; Lu와 Koeris 2011). 항생제의 과다사용과 항생제 저항성 유전자의 전이, 세균의 진화에 따른 항생제 내성균의 생성과 항생제 저항성의 증가는 새로운 향균물질을 필요로 하고 있고, 박테리오파지나 항세균성 펩티드, 단백질, 나노입자 등이 개발되고 있다. 이들 중 박테리오파지는 기본적으로 자체 독성이 없기에 2000년 이후 미국 및 유럽의 산업체에서 제품화되어 이용되고 있으나(Abedon과 Tho nas-Abedon 2010), 파지의 생태학적, 생물학적 이해가 부족하여 파지테라피에 대한 부정적 견해와 사용상의 약점도 커져왔다(Skurnik와 Strauch 2006). 파지에 대한 꾸준한 연구로 파지의 생태가 밝혀지고 있고, 숙주균 범위의 제한성, 제품화, 임상적 처리방법 등의 발전에 따라 파지관련 생산품들이 FDA, USDA, EPA 등에시 사용허가를 받았고(FDA 2006), 대장균이나 살모넬라 균 등 병원성 세균을 방제하기 위한 파지관련 생산물들이 개발되고 있다(Abuladze 등, 2008).</p> <p>본 연구에서는 갈반병이 발생한 느타리버섯 재배농가에서 병원성 균주들을 분리동정하여 분류하였고(Yun 등, 2013; Mu 등, 2015), 이들을 억제하는 독성파지를 재배사 인근이나 농가 인근의 하수에서 분리하였다. 분리한 파지는 파지테라피에 사용하기 위하여 숙주균에 대한 민감도를 조사하였고, 숙주균의 사멸효과가 높은 파지혼합액을 구성할 파지 종류를 선정하였다. 파지는 갈반병 균주에 매우 특이적으로 작용하였고 살균효과가 뛰어나 파지테라피를 위한 유용한 균주로 확인되었다. 하지만, 파지와 숙주균의 배양시간이 길어짐에 따라 파지에 대하여 저항성을 갖는 균주가 나타났기에, 원래의 숙주균과 여기서 발생한 파지저항성 균주들의 특성조사를 위하여 유전자적, 생화학적, 병원성의 차이를 조사하였다.</p> <h1>재료 및 방법</h1> <h2>파지저항성 균주의 분리</h2> <p>파지저항성 균주는 갈반병 원인균주 Pseudomonas tolaasii를 Pseudomonas agar F (Bacto-peptone \( 10 \mathrm { ~g } \), Bacto-tryptone \( 10 \mathrm { ~g } \), \( \mathrm { K } _ { 2 } \mathrm { HPO } _ { 4 } 1.5 \mathrm { ~g } , \mathrm { MgSO } _ { 4 } 1.5 \mathrm { ~g } \), glycerol \( 10 \mathrm { ~mL } \), agar \( \left .15 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } \right ) \) 평판배지 위에 도말한 뒤 파지를 점적하여 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 48시간 동안 배양하며, 용균반 내부에서 발생한 콜로니에서 분리하였다.</p> <h2>생화학적 대사 측정</h2> <p>분리한 저항성균주의 특성을 조사하기 위하여 API kit(Biomérieux, Paris, France)를 이용하여 생화학적 대사특성을 측정하였다. 측정방법은 제조사의 지침을 따랐으며, 간략히 저항성 균주의 콜로니를 분리하여 현탁하고, \( \mathrm { NO } _ { 3 } \)부터 PNPG까지 8개의 큐플의 아랫부분에 주입하였다. 이 중 GLU, ADH, URE는 무기오일을 첨가하여 혐기성 조건으로 만들어줬다. 나머지 측정의 경우는 균주 균질액을 큐플의 윗부분까지 채워준 후 키트를 \( 29 \pm 2 ^ {\circ } \mathrm { C } \)에서 24시간동안 배양하고 지침에 따라 결과를 판정하였다.</p> <h3>버섯조직함몰 검정법</h3> <p>버섯조직 함몰검정(pitting test)은 Gandy (1968)의 방법에 따라 양송이버섯을 이용하여 실시하였다. 양송이버섯은 갓 부분을 절단하여 사용하였다. 비섯의 갓 위 부분 \( 1 / 3 \)을 절단하고, 절단면에 균주의 배양액( \( 10 ^ { 8 } -10 ^ { 9 } \) cfu/mL)이나 tolaasin 주출액 \( 10 \mu \mathrm { L } \) 점적하여 흡수시켰다. 이것을 증류수로 적신 여과지를 깔아준 사각플라스틱는 용기(square dish)에 담아 12-24시간 동안 항온기에서 \( 25 ^ {\circ } \mathrm { C } \)로 배양하였다. 버섯을 넣은 후에는 밀봉하여 수분 증발을 방지하였다. 최종적인 평가는 점적부위의 변색과 함몰을 관찰하여 이루어졌다.</p>	[ "느타리버섯은 국내 버섯산업에 총 생산량과 소비량 상위권을 차지하며, 재배에 따른 고소득이 가능하여 농가에서 선호하는 작물이다. 박테리오파지는 바이러스의 종류 중 하나로서, 최근에는 다양한 항생제에 내성을 가져 세균의 출현에 따라서 기존 항생제에 대한 대체방안으로 연구의 중심이 된다. 또한, 분리한 파지는 파지테라피에 활용하기 위해 숙주균에 대한 민감도를 살펴보았으며 숙주균의 사멸효과가 높아 파지혼합액을 구성하는 파지 종류를 선택했다. 분리 된 저항성균주의 특징을 조사하려면 API kit를 이용해 생화학적 대사특성을 관측했다." ]
55e-0c9-merge_2_28a7cd33-576e-448f-88bb-93af9dad2859_02	생명LA	박테리오파지 저항성을 갖는 Pseudomonas tolaasii 변이주 분리 및 이들의 병원특성	<h2>균주의 유전적 특성</h2> <p>저항성 균주가 원래의 숙주균으로부터 유래된 것을 확인하기 위하여 \( \mathrm { 16S } \) \( \mathrm { rRNA } \) 유전자 염기서열을 분석하고, 원래의 숙주균의 염기서열과 비교하였다. 각각의 숙주균으로부터 얻은 저항성균의 유전자 염기서열은 정확하게 숙주균의 유전자와 일치하였으며, 계통수 분석에서 같은 균주로 확인되었다(Fig. 2). 이러한 결과는 각 저항성 균주가 원래의 숙주균으로부터 유래하였음을 보여주며, 파지에 대한 저항성을 획득하는 과정에서 \( \mathrm { 16S } \) \( \mathrm { rRNA } \) 유전자의 염기서열에는 전혀 변화가 없었음을 확인하였다.</p> <h2>균주의 생화학적 특성</h2> <p>파지저항성 획득으로 인한 균주의 대사특성에 변화 여부를 확인하기 위하여 API kit를 이용하였고, 총 22 가지의 대사활성을 원래의 숙주균과 비교하여 측정하였다. Pl \( \alpha \) 세분류 균주들의 생화학적 활성은 Table 1에 보였다. 숙주균과 저항성 변이주 사이에 대부분의 생화학적 대사활성이 일치하였으나, P. tolaasii \( 6264 \mathrm { R } \)과 \( \mathrm { HK } 2 \mathrm { R } \) 균주의 경우 각각 7가지와 8가지의 대사활성이 원래의 숙주균과 추이를 보여 파지저항성 획득과 함께 생화학적 대사활성에도 큰 변화가 나타났다. 그러나, HK3R 균주와 \( \mathrm { HK } 4 \mathrm { R } \) 균주, \( \mathrm { HK } 5 \mathrm { R } \) 균주는 각각 1가지, 3가지, 1가지의 대사활성이 원래의 숙주균과 다르게 나타나, 파지저항성 변이주의 생화학적 활성은 원래의 숙주균과 큰 변화를 보이지 않았다. \( \mathrm { P } 1 \beta \) 와 \( \mathrm { Pl } \gamma \) 세분류 균주는 각각 \( P \). tolaasii \( \mathrm { HK } 19 \mathrm { R } \) 균주와 \( \mathrm { HK } 2 { } ^ {\top } \mathrm { R } \)을 대표균주로 생화학적 대사 변화여부를 조사하였으나, \( \mathrm { HK } 19 \mathrm { R } \) 저항성 균주의 경우 대사활성의 변화가 없었고, HK23R 균주는 1가지 대사활성의 변화가 있었다(Table 2). 이상의 결과를 통하여 숙주균이 파지저항성을 획득할 때, 파지저항성 획득과 동시에 대사활성에도 변화가 유발될 수 있으나 변화정도는 균주에 따라 다르게 나타남을 알 수 있었다.</p>	[ "16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 통해 원래의 숙주균과 저항성 균주의 유래를 비교하였다. 숙주균과 저항성 변이주는 대부분의 생화학적 대사활성이 일치했지만, P. tolaasii 6264R과 HK2R 균주에서는 각각 7가지와 8가지의 대사활성이 원래의 숙주균과 다르게 나타났다. 한편, HK3R, HK4R, HK5R 균주에서는 1가지, 3가지, 1가지의 대사활성이 원래의 숙주균과 다르게 나타났으나, 이는 파지저항성 변이주의 생화학적 활성에 큰 변화가 없음을 시사한다." ]
55e-0c9-125bc2eb-94b8-4a12-975f-2f4064b2dd56	생명LA	박테리오파지 저항성을 갖는 Pseudomonas tolaasii 변이주 분리 및 이들의 병원특성	<h1>고 찰</h1> <p>느타리버섯의 상업적 대량재배에서 가장 문제가 되는 것은 세균성갈반병의 발생이고, 본 연구는 박테리오파지를 이용하여 친환경적으로 갈반병 세균을 제어할 수 있는 방안을 강구하는 일환으로 수행되었다. 세균성갈반병은 P. tolaasii 균주가 분비하는 펩티드인 tolaasim에 의해서 버섯세포가 파괴되어 나타나는 병징으로, 이를 분비하는 병원성세균을 박테리오파지를 이용하여 사면시키면 근원적인 갈반병의 억제가 가능할 것이라는 파지테라피 방법이다. 느타리버섯 재배농가에서 세균성갈반병 유발균주인 P. toluasii 균과 이를 제어하는 독성파시(virulent phage)를 분리하고, 효과적인 파지테라피 방안을 선행연구를 통하여 마련하였다. 병원성 세균인 갈반병균의 특성과 파지를 이용한 파지테라피의 효과는 입증하였으나(Yun 등, 2013), 파지의 특성이나 파지테라피의 단점인 파지저항성 균주에 관련된 연구가 추가적으로 요구되었다. 파지는 숙주균에 매우 특이적으로 작용하여 저항성이 없는 병원성 숙주균을 효과적으로 사멸시키거나, 숙주균이 파지에 대하여 저항성을 가질 수 있기 때문에 한 숙주균에 대하여 사멸효과를 갖은 2가지 이상의 파지를 선정하여 혼합처리 한다면 저항성균의 피해를 효과적으로 막을 수 있을 것이다 (David 등, 2011).</p> <p>파지저항성 균주는 파지민감성 균주가 파지의 세균침투 기작을 저해하는 능력의 획득으로 나타난다(Labrie 등, 2010). 파지저항성 능력은 숙주균이 다양한 파지흡착 기작을 저해하거나, 파지유전자의 유입을 막거나, 파지유전자를 절단하여 무력화시키기나, 파지유전자의 작용을 억제하는 등의 능력을 갖게 됨으로써 나타난다. 파지저항성 균주는 파지테라피 시에 종종 발생하여 파지혼합액의 효과를 무력화시킬 수 있으므로 파지저항성 균주의 병원특성의 조사가 필요하다. 파지가 용균반을 생성하였을 때, 일부 균주의 경우 투명한 용균반 내부에서 볼투명한 균주성장반이나 콜로니를 발견하였다. 용균반 내부에서 성장하는 균주는 숙주균에 파지를 처리하였을 때 저항성을 획득하여 나타났거나, 아니면 파지가 특이적으로 사용하지 못하는 다른 균주의 오염에 의해서 나타났을 것이다. 새로이 나타난 균주의 \( 16 \mathrm{~S} \) rRNA 유전자 염기서열을 분석하고 계통수 분석을 수행하였을 때, 기존의 숙주균과 파지저항성 균주로 분리된 균주가 같게 분류되어 새로이 나타난 균주는 숙주균이 파지저항성을 획득한 것임을 확인하였다.</p> <p>이렇게 얻어진 파지저항성 균주는 동일한 파지에 의해 사멸되지 않았다. 그러므로 파지에 대한 저항성 획득 과정 중 균주의 특성에 어떠한 변화가 있었는지 확인하기 위하여 생화학적 대사의 변화, 세포독성을 평가하는 용혈활성과 갈반형성능의 변화를 즉정하였다. 파지저항성을 획득한 균주들은 유전적인 특성이 같은 \( \mathrm{P} 1 \alpha \) 균주임에도 불구하고 각각 다른 변화가 관찰되어 생화학적 대사특성과 파지 저항성 사이에는 일정한 상관성이 없다는 결론을 얻었다. 그러나, 이러한 파지저항성 균주 중 \( \mathrm{HK} 5 \mathrm{R} \)은 용혈활성과 버섯함몰 활성을 기존의 균주와 비교하였을 때, 세포독성이 약해지거나 사라져 직혈구 파괴가 이루어지지 않았고, 갈반형성이 약해지는 것을 확인하였다. 이는 P. tolaasii \( \mathrm{HK} 5 \) 균주가 파지 \( \phi \mathrm{HK} 5 \)의 자국에 의해 저항성을 획득할 때, 세포독성 물질을 분비하지 못하는 비병원성 균주로 변이 된 것으로 보인다(Simon 등, 2010; Julie 등, 2013). 이것은 HK23 균주에서도 유사하게 관측되어 파지저항성 획득과 세포독성 감소 사이에 상관관계를 분자수준에서 조사하여 밝혀냄으로써 숙주균 특성에서의 파지테라피 문제점을 이해하여야 이 방법의 효율을 높일 수 있을 것이다.</p>	[ "상업적 대량재배에서 느타리버섯의 가장 큰 문제는 세균성 갈반병의 발생이다. 이 연구는 박테리오파지를 사용하여 친환경적으로 갈반병 세균을 통제하는 방법을 연구하였다. 파지는 특이적으로 숙주균에 작용하여 병원성이 없는 숙주균을 효과적으로 제거하거나, 숙주균이 파지에 대해 저항성을 가질 수 있는 특성을 가지고 있다. 따라서 한 숙주균에 대해 파지의 사멸효과를 갖는 두 가지 이상의 파지를 혼합 처리한다면 저항성 균의 피해를 효과적으로 예방할 수 있다. 파지 저항성 획득 과정에서 균주의 특성 변화를 확인하기 위해 생화학적 대사의 변화, 용혈활성 및 갈반형성능을 평가하였다. 파지 저항성을 획득한 균주들은 유전적인 특성이 동일한 \\( P1\\alpha \\) 균주임에도 불구하고 각기 다른 변화가 관찰되었다. 이로부터 생화학적 대사특성과 파지 저항성 사이에 일정한 상관성이 없음을 알 수 있었다. 그러나 \\( HK5R \\)과 같은 파지 저항성 균주는 용혈활성 및 버섯함몰 활성이 기존 균주와 비교하여 약해지거나 사라지며, 갈반형성능도 약해지는 것을 확인하였다." ]
55e-0c9-6627d3ab-f897-4337-b9e9-b3db36491aee_00	생명LA	펜톤산화에 의한 바이오매스 분해향상과 펜톤산화 용액 재사용 평가	<h2>2.3 펜톤산화 용액에 존재하는 \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } , \mathrm { OH } \) 라디칼 및 \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 농도 분석</h2> <p>펜톤산화 용액에 존재하는 \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } \) 농도는 ferrozine [ \(3 \)-( \(2 \)-Pyridyl)- \( 5 \), \(6 \)-diphenyl- \(1,2,4 \)-triazine \( - \mathrm { p } \), \( \mathrm { p } ^ {\prime } \)-disulfonic acid monosodium salt hydrate; Sigma Aldrich]를 이용하여 분석하였다. 펜톤산화 용액(0.1 mL)과 \( 10 \mathrm { mM } \)의 ferrozine 용액 \( 0.1 \mathrm { ~mL } \) 를 혼합하여 실온에서 \(10 \) 분 동안 반응하였다. \( \mathrm { Fe } ^ { 2 + } \) 의 농도는 \( 562 \mathrm { ~nm } \) 의 파장에서 UV-Vis spectrophotometer(JP/UV1800, Shimadzu, Japan)로 측정하였다. \( \mathrm { OH } \) 라디칼 농도는 Fricke dosimetry를 이용하여 측정하였다. Fricke 용액은 \( 1 \mathrm { mM } \mathrm { FeSO } _ { 4 } , 0.4 \mathrm { M } \) \( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { SO } _ { 4 } , 1 \mathrm { mM } \mathrm { NaCl } \) 을 혼합하여 제조하였다. \( \mathrm { OH } \) 라디칼 농도는 펜톤산화 용액과 Fricke 용액을 혼합한 후 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 \( 304 \mathrm { ~nm } \) 에서 측정하였다.</p> <p>\( \mathrm { H } _ { 2 } \mathrm { O } _ { 2 } \) 농도는 iodometric titration에 의해 측정하였다. 회수된 펜톤산화 용액(1 mL), 증류수(50 mL), 4 \( % \) sulfuric acid 용액 (10 mL), 1 \( % \)(w/v) KI 용액(10 mL), ammonium molybdate 용액( \( (0.4 \mathrm { M } \), \( 50 \mu \mathrm { L } ) \) 을 혼합한 후 sodium thiosulfate \( (0.1 \mathrm { ~N } ) \) 용액으로 적정하였다.</p>	[ "펜톤산화 용액 내의 \\(\\mathrm{Fe}^{2+}\\) 농도는 ferrozine을 사용하여 분석되었습니다. 또한, \\(\\mathrm{OH}\\) 라디칼 농도는 펜톤산화 용액과 Fricke 용액을 혼합한 후 UV-Vis spectrophotometer를 이용하여 \\(304\\mathrm{~nm}\\)에서 측정되었습니다. 마지막으로, \\(\\mathrm{H}_{2}\\mathrm{O}_{2}\\) 농도는 iodometric titration을 통해 측정되었습니다." ]
55e-0c9-31881334-8288-4690-9b0c-3ebd6331a4f9_01	생명LA	펜톤산화에 의한 바이오매스 분해향상과 펜톤산화 용액 재사용 평가	<p>열수처리 과정에서 생성되는 하이드로늄 이온은 자일란을 불규칙적으로 분해하여 낮은 중합도를 가지는 자일로-올리고당을 생성한다 . 펜톤산화-열수처리 \( ( \mathrm { FO } - \mathrm { HT } ) \)과정에서는 올리고당이 생성되지 않았다. 이것은 펜톤산화처리 바이오매스로 열수처리를 수행한 결과 대부분 단당류로 변환되었음을 의미한다. 펜톤산화를 수행하지 않고 열수처리만 수행했을 경우( \( \mathrm { RM } - \mathrm { HT } ) \) 높은 농도의 자일로-올리고당( \( (7.66 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } ) \) 을 생성하였다. 반면 펜톤산화 용액을 재사용하여 열수처리를 수행한 결과 상대적으로 낮은 농도의 자일로-올리고당을 생성하였다 \( (1.53-4.78 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } ) \). 펜톤산화 용액 재사용 조건에 따라 차이를 나타냈으며 펜톤산화 용액 재사용을 위해 고농도의 펜톤시약으로 조정한 경우 ( \( \mathrm { FO } - \mathrm { R } 2- \mathrm { HT } \), \( \mathrm { FO } - \mathrm { R } 3- \mathrm { HT } ) \) 자일로-올리고머 함량이 상대적으로 높았다 \( (4.60-4.78 \mathrm { ~g } / \mathrm { L } ) \). 재사용된 펜톤산화 용액은 최초 펜톤산화 용액을 대체할 수 없으나 펜톤산화 없이 열수처리(RM-HT) 조건과 비교하여 뚜렷한 가수분해 효과를 나타냈다.</p> <p>Fig. \(4 \)는 원시료와 펜톤산화 처리된 고형바이오매스의 열수처리 후 구성성분 분석결과이다. 최초 펜톤산화-열수처리 ( \( \mathrm { FO } - \mathrm { HT } ) \) 조건에서 \(34.75 \% \)의 가장 높은 분해율을 나타냈다. 펜톤산화 용액 재사용 후 열수처리의 분해율( \(29.24 \)- \( 31.05 \%) \) 은 \( ( \mathrm { FO } - \mathrm { HT } ) \) 조건에 비해 상대적으로 감소하였다. 하지만 펜톤산화 처리 없이 열수처리를 수행한 경우( \( \mathrm { RM } - \mathrm { HT } ; 15.21 \%) \) 보다 약 \(2 \) 배 이상의 분해 효과를 나타냈다. 열수처리에 의해 헤미셀룰로오스가 선택적으로 분해되므로 분해율이 높을수록 자일란의 함량이 감소하였고 상대적으로 글루칸과 리그닌의 함량이 증가하였다. 이것은 Table \(2 \)의 결과와 일치하였다.</p>	[ "열수처리 과정 중 생성되는 하이드로늄 이온이 자일란을 분해해 자일로-올리고당을 형성한다는 사실이 관찰되었으며, 펜톤산화 용액을 재활용하여 열수처리를 진행했을 때는 자일로-올리고당의 농도가 상대적으로 낮았다. 고농도의 펜톤시약으로 펜톤산화 용액을 재사용하면, 자일로-올리고머의 함량이 높아졌다. 재활용한 펜톤산화 용액은 원래의 용액을 완전히 대체할 수 없었지만, 펜톤산화 없이 열수처리를 했을 때보다 가수분해 효과가 크게 나타났다. 열수처리 과정에서 헤미셀룰로오스가 분해되면서 자일란의 함량이 감소하고, 상대적으로 글루칸과 리그닌의 함량이 증가했다." ]

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